1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。预测指标 :1.抗氧化酶系统、MDA2. 可溶蛋白、 超氧阴离子自由基3.叶绿素、类胡萝卜素4.可溶性糖5.游离氨基酸6.过氧化氢7. 谷胱甘肽、 ASA1. 抗氧化酶系统、MDAA 酶活测定试剂 :PBS 缓冲液 0.05M( pH 7.8) : 取 0.663g NaH2PO4 2H2O 和 16.384g Na2HPO412H2O, 加 PVP10g, 并加 EDTA 或者 EDTA 盐, 使其浓度为 2mM, 加蒸馏水定容至 1L 。用前冰箱或冰上预冷。样品制备鲜样 0.1-0.5g 加入 1 ml 磷酸缓冲液 ( 0.05
2、M, pH 7.8) , 稍许石英砂 ,研磨成匀浆 ; 移入 10 ml 离心管中 , 再用 4ml 磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中 ; 10000 g 4下离心 20 min; 上清夜贮于4冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份 (0.1g 左右 )烘干称重。SOD( =560nm)试剂配制 :1LPBSMet1.93973g缓冲NBT 氮蓝四唑 0.061323g液中EDTA-Na20.0037224g资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。加入核黄素0.00075272g实验步骤:2.725mL2.75mL反应液反应液250uL 250uL蒸馏水蒸馏水 (25
3、uL 酶液光照作为【样品管】100%CK)【照光对照管】2.75mL 反应液 250uL 蒸馏水 ( 黑暗作为调零 )【空白调零管】4000lx 日光灯下反应20 分钟 , 560nm 比色。反应温度2535。已知 SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50为一个酶活性单位 表 示 按 下 式 计算SOD 活 性 : SOD 总 活 性 ( Ack AE)*V/( 0.5*Ack*w*Vt)( 式中 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示, Ack 为照光对照管的吸光度 , AE 为样品管的吸光度, V 为样品液的总体积ml, Vt 为测定时样品用量 ml, w 为样品鲜重g) 【空白调零管】
4、可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。【样品管】和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。POD ( =470nm 比色 )试剂配制 : 1.5%愈创木酚 ( 1.5ml 愈创木酚 , 用蒸馏水定容到100 ml)300uM 的 H2O2: 取 30的 H2O2 1.53ml, 用蒸馏水定容到 50 ml; 实验步骤 :100ul 酶液 +2700ulPBS+100ul 愈创木酚 +100ul H2O2, 于普通比色皿 ,轻轻摇匀 2-秒 , A470 动力学测定1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity, 此后测定均参考该时间段。结果计算 : POD(m
5、mol/g)=activity A Va/(E w)A 反应液总体积 /ml; V 提取液总体积 /ml; a 测定液体积 /ml; w 材料鲜重/g; E 吸光系数 /mM cm-1资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。CAT( 240nm 比色 )试剂配制 :300uM 的 H2O2: 取 30的 H2O2 1.53ml, 用蒸馏水定容到 50 ml;实验步骤 :100ul 酶液 +2800ulPBS+100ul H2O2, 于石英比色皿 , 轻轻摇匀 2-秒, A240 动力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity,此后测定均参考该时间段
6、。结果计算 : CAT (mmol/g)=activity A V a/(E w)APX(=290nm 比色 )试剂配制 :7.5mM 的抗坏血酸 (AsA): 66mg AsA 用蒸馏水定容到50ml;300uM 的 H2O2: 取 30的 H2O2 1.53ml, 用蒸馏水定容到50 ml;实验步骤 :100ul 酶液 +2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2,于石英比色皿 , 轻轻摇匀 2-秒, A290 动力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity, 此后测定均参考该时间段。结果计算 : CAT (mmol/g)=activity A
7、V a/(E w)B. 丙二醛 ( MDA)含量的测定 ( =450, 532, 600nm比色 )试剂配制 :5%三氯乙酸 ( TCA) : 25g 三氯乙酸定容到500mL 。MDA 反应液 : 2.5g 硫代巴比妥酸 , 先用少量 1M 的氢氧化钠溶解 , 再用 5%三氯乙酸定容到 500mL 。实验步骤 :0.5mL 酶液 2.5mL 反应液 , 沸水浴反应15 分钟 , 立即冰浴,资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。4800rpm 离心 10 分钟 , 上清转入新管 , 波长 450,532 和 600 下比色 ,MDA 反应液调零。结 果 计 算 :丙 二
8、 醛 含 量 (nmol.g-1) (D532 D600)*A*V/( a*1.55*10-1*w)式中 A 为反应液总量 ( mL) ; V 为提取液总量 ( mL) ; a 为测量用提取液量 ( mL) ; w 为材料鲜重 ( g) 。1.5510-1 为丙二醛的 umol/L 消光系数 ( nmol/mL 消光系数 )或者 : MDA 浓度 (umol/L)=6.45(D532 D600) 0.56D450丙二醛含量 ( umol.g-1) = MDA 浓度提取液总体积 (ml)/ 组织鲜重 (g)/1000-植物体可溶性蛋白质含量测定比色原理 :染料考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈
9、红色 , 当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色 , 前者最大光吸收在 465nm, 后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内 ( 0 100g/ml) , 蛋白质色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡 , 完成反应十分迅速 , 其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该反应非常灵敏 , 可测微克级蛋白质含量 , 因此是一种比较好的蛋白质定量法。【试剂】1、 65mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH7.8);如超氧阴离子自由基含量测定用。称取K2HPO43H2O(MW=228.22)9.
10、1234g和资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。KH2PO4(MW=136.09)3.406g,蒸馏水定容到1L。或 K2HPO4 3H2O4.562g 和 KH2PO4 1.703g, 蒸馏水定容到0.5L 。2、 考马斯亮蓝G-250: 称取 100mg 考马斯亮蓝G-250 溶于 50ml90%乙醇中 , 加入85%( W/V)磷酸100ml, 最后用蒸馏水定容至1000ml 。滤纸过滤后低温储存。常温下可放置一个月;3、 磷酸 ( 85%, W/V) :也即商业磷酸 (浓度 85%)。直接用。4、0.15M 的 NaCl ( 标准曲线用 ): NaCl0.87
11、66g 蒸馏水定容到 100ml 。【方法】1.标准曲线的绘制血清白蛋白 (BSA) 先用 0.15M 的 NaCl 配制成 2mg/ml 的原液。表 1 配制 01000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液 (ml)00.10.20.30.40.5磷酸钾缓冲液量 (ml)1.00.90.80.70.60.5蛋白质含量 ( g/ml)02004006008001000以上各管混匀后 , 各取 0.1ml 于新的 10ml 离心管内 , 各加 5ml 考马斯亮蓝染液 , 混匀放置 2min, 在 595nm 下比色 , 绘制标准曲线。折衷:表 2 配制 0 1000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液 (ul)01020304050磷酸钾缓冲液量 (ul)1009080706050蛋白质含量 ( g/ml)02004006008001000以上各管混匀后, 各加 5ml 考马斯亮蓝染液, 混匀放置2min, 在595nm 下比色 , 绘制标准曲线。2.样品提取液中蛋白质浓度的测定样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液0.1ml 于新的10ml 离心管内 , 各加 5ml 考马斯亮蓝染液, 混匀放置2min, 在 595nm 下比色。
