1、 关于组蛋白高乙酰化介导的 Egr-1 结合促进 gdnf 基因高转录胶质细胞系源性神经营养因子(GNDF) 是一种新型的神经营养因子，属于转化生长因子-(TGF-) 超家族成员，在胚胎发育过程中的表达量迅速上调，至成年期维持在较低水平。由于 GDNF 对多巴胺能神经元特异的营养作用，一直作为治疗帕金森病的潜在药物而备受关注。最近的研究表明，GDNF 还是胶质瘤细胞强有力的促增殖因子，它在胶质瘤细胞中的表达量显著高于正常胶质细胞，并且能够促进胶质瘤细胞的迁移。目前，有关 GDNF 对胶质瘤细胞促增殖和迁移机制的研究很多，但是对于 gdnf 基因高转录的发生机制却知之甚少。基因的异常高转录通常与
2、基因突变以及表观遗传学改变有关。我们前期的研究发现，胶质瘤细胞中 gdnf 基因的异常高转录与基因突变无关，而与该基因启动子 II 区组蛋白 H3K9 的高乙酰化修饰有关。诸多的研究已表明，启动子区组蛋白的高乙酰化修饰可以使该区域染色质中的核小体呈排列松散的开放状态，从而利于转录因子与之的结合，进而促进基因的转录。近来的研究发现，gdnf 基因启动子 II 区转录起始位点上游(-186 bp)存在 3 个连续且高度保守的转录因子 Egr-1 的结合序列，且 Egr-1 参与了胶质细胞中成纤维细胞生长因子和丙咪嗪诱导的 gdnf 转录激活。由此我们推测，胶质瘤细胞中 gdnf 基因启动子 II
3、区组蛋白高乙酰化可能以升高转录因子 Egr-1 与之结合能力的方式引发该基因的异常高转录。为了验证以上假说，我们以大鼠 C6 星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞为研究对象，利用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法检测了以上两种细胞中 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点区域 H3K9 的乙酰化水平以及 Egr-1 与之的结合能力;通过组蛋白乙酰化酶(HAT) 抑制剂Curcumin 和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂 TSA16建立的 gdnf基因启动子 II 区乙酰化改变的 C6 胶质瘤细胞模型，检验了 gdnf 基因启动子区 Egr-1 结合位点区域组蛋白乙酰化修饰水平、Eg
4、r-1 与之的结合能力以及该基因转录水平之间是否存在必然的联系。1 材料和方法1.1 主要试剂大鼠 C6 星形胶质瘤细胞株和正常星形胶质细胞为本实验室冻存。 DMEM/F12 培养基胎牛血清购自美国Gibco，ChIP 级兔源抗乙酰化组蛋白 H3(Lys9)多克隆抗体(货号 07-352)、 EZ-ChIP 试剂盒购自 Millipore，兔源抗 Egr-1 多克隆抗体( 货号 sc-110X)购自 Santa Cruz，Curcumin 、TSA 和二甲基亚砜(DMSO)均购自 Sigma-Aldrich，TRIzol 购自 Invitrogen，Prime ScriptTMII 逆转录试剂
5、盒、SYBR Premix Ex TaqTMII 试剂盒购自大连TaKaRa。1.2 细胞培养及药物处理将实验室冻存的大鼠正常星形胶质细胞和 C6 胶质瘤细胞复苏于含有 10%胎牛血清(美国 Gibco)的DMEM/F12 培养基(美国 Gibco 公司)的培养液中，置于 37 ，5% CO2 饱和湿度培养箱内培养，每两天换 1 次液。取 23 代生长良好的大鼠 C6 星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞用于后续试验。将处于对数生长期的 C6 胶质瘤细胞，以 1105/ml 细胞浓度接种于六孔板，每孔 2 ml。待细胞生长至 80%汇合度时，将培养液更改为含有 0.5%牛血清白蛋白(美国 Sigm
6、a-Aldrich)的无血清 Opti-MEM(美国 Invitrogen)，在相同条件下培养 24 h。然后再更换为含有TrichostatinA(终浓度为 200 nmol/ L)或 Curcumin(终浓度为 50 mol/L)(均购自美国 Sigma-Aldrich)的新鲜无血清 Opti-MEM 培养基继续培养 24h，其中对照组添加等体积的溶剂 DMSO。1.3 ChIP-PCR 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验使用兔抗乙酰化H3K9 抗体、兔抗 Egr-1 多克隆抗体和正常兔源 IgG，按 EZ-ChIP chromatin immunoprecipitation kit 说明书
7、的步骤操作。 ChIP 实验后，采用 real-time PCR 的方法检测目的抗体免疫沉淀下来的 DNA。PCR反应体系为：12.5 l SYBR Premix Ex TaqTMII;上下游引物(F：5CGAGGAGGTGCAGAGTGAGG3， R： 5GGGAG-CAAGAGCACGCAA 3;10 mol/L)各 1 l 以及 DNA 模板 3 l;加灭菌消毒的双蒸水补充至总体积25 l。用三步法 PCR 反应程序(预变性： 95 2 min;PCR 反应：95 15 s，60 30 s，72 20 s，共 40 个循环)进行扩增。PCR 产物大小为 283 bp。Real-time
8、PCR 后采用 2-Ct 法对数据进行相对定量，以%Input 的形式计算结果：%Input =2(CtInput-CtChIP)Input dilution factor100。Real-time PCR 引物由康成生物(上海) 公司合成。1.4 Real-time PCR 采用 TRIzol(Invitrogen)一步法从细胞中提取总 RNA，以 1 g 总 RNA 为模板按 Prime ScriptTMII 逆转录试剂盒说明行逆转录反应合成 cDNA 第一链。利用 SYBR Premix Ex TaqTMII 试剂盒在反应体系(20 l)下进行实时定量 PCR：SYBR Premix E
9、xTaqTMII 10 l、上下游引物(10 mol/L)各 0.5 l、cDNA 模板 1 l 和无核酶水 8 l。通过LightCycler480 荧光定量 PCR 系统(Roche)进行实时荧光定量分析。反应条件设置如下：95 预变性 30 s;95 变性 20 s，60 退火 15 s;72 延伸 15 s，扩增 40 个循环。通过溶解曲线分析 PCR产物特异性。每个样品以 gapdh 基因的 mRNA 表达作为内参照，通过相对定量(2-CT) 法计算目的基因在各样品中相对 mRNA 的表达水平。靶基因和内参基因扩增的上下游引物序列见表 1。1.5 统计学分析所有数据均采用统计软件 S
10、PSS16.0 进行处理，计量资料以均数标准差表示。其中，两样本均数比较采用独立样本 t 检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析。取 P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 超声断裂染色质后 DNA 的电泳结果大鼠 C6 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞经超声破碎染色质后各取 20 l 直接进行解交联和纯化 2%琼脂2.2 大鼠 C6 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点处 H3K9 的乙酰化水平 ChIP-PCR 结果显示：大鼠 C6 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中 gdnf 基因启动子 II区的组蛋白 H3K9 均发生了不同程度的乙
11、酰化修饰。与正常星形胶质细胞相比，C6 胶质瘤细胞中 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点区域组蛋白 H3K9 的乙酰化程度极显著升高(P0.01，图 2)。2.3 大鼠 C6 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中 Egr-1 与gdnf 基因启动子 II 区的结合情况 ChIP-PCR 结果显示：C6 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中转录因子 Egr-1 都能够不同程度地与 gdnf基因启动子 II 区潜在的 Egr-1 结合位点区域结合。与正常星形胶质细胞相比，C6 胶质瘤细胞中 Egr-1 与 gdnf 基因启动子 II 区的结合量极显著升高(P0.01，图 3)。2.4 大鼠
12、C6 胶质瘤细胞中 gdnf 基因启动子 II 区 H3K9 乙酰化修饰介导的 Egr-1 与之的结合能力调节该基因的转录我们采用Curcumin 和 TSA 的药物处理建立了 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点处乙酰化水平改变的 C6 胶质瘤细胞模型，即 50 mol/L Curcumin 处理 24 h 后，显著降低了 gdnf 基因启动子II 区 Egr-1 结合位点处 H3K9 的乙酰化水平 ;相反的，200 nmol/LTSA处理 24 h 后，显著提高 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点处H3K9 的乙酰化水平(图 4A)。在此基础上，采用 Ch
13、IP-PCR 和 real-time PCR 技术检测了 gdnf 基因启动子 II 区 H3K9 乙酰化修饰改变对Egr-1 与之的结合能力及该基因转录水平的影响。结果显示，gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点处 H3K9 低乙酰化修饰，减少 Egr-1 与之的结合的同时，降低了 gdnf mRNA 的表达 (P0.05);而且，gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点处 H3K9 高乙酰化修饰，在促进Egr-1 与之结合的同时，提高了 gdnf mRNA 的表达(P0.05，图4B，C) 。3 讨论Egr-1 是 gdnf 基因活化的关键转录因子。为了探明 gd
14、nf 基因启动子 II 区组蛋白 H3K9 高乙酰化修饰促进该基因高转录的作用机制，我们利用 ChIP-PCR 的方法检测了大鼠 C6 星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中该启动子区 Egr-1 结合位点区域组蛋白 H3K9的乙酰化状态。K9 是组蛋白 H3 调节基因转录激活最为活跃的乙酰化位点。结果显示，C6 胶质瘤细胞中 gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1靶向区域发生了组蛋白 H3K9 的高乙酰化修饰(图 2)，与我们之前的研究结果相似，表明组蛋白 H3K9 高乙酰化修饰可能影响到 Egr-1与 gdnf 基因启动子 II 区的结合。为了验证以上推测，我们利用ChIP-PCR 的方法
15、检测了大鼠 C6 星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中 Egr-1 与 gdnf 基因启动子 II 区潜在的结合位点的结合情况，发现 C6 胶质瘤细胞中 Egr-1 能够与 gdnf 基因启动子 II 区潜在的结合位点结合，并且较之正常胶质细胞 Egr-1 的结合量显著升高(图 3)，与我们的推测相一致。此外，Shin 等人发现缺失 Egr-1 结合位点显著下调了 gdnf 基因启动子 II 区的启动活性，表明 Egr-1 的结合能够促进 gdnf 基因的转录活性。由此，我们提出本文的假说，gdnf 基因启动子 II 区组蛋白高乙酰化介导的 Egr-1 与之结合量的升高促进了C6 胶质瘤细胞中该
16、基因的高转录。为了进一步证实以上假说，我们利用以往的实验结果筛选了 Curcumin 和 TSA 处理 C6 胶质瘤细胞的最佳作用时间及作用浓度，并在此基础上建立了 gdnf 基因启动子 II区 Egr-1 结合位点乙酰化改变的 C6 胶质瘤细胞模型。发现，Egr-1 呈组蛋白 H3K9 乙酰化依赖的方式结合到 gdnf启动子 II 区，并且促进了 gdnf 基因的转录，与我们的预期相符( 图 4)。综上所述，本研究发现了大鼠 C6 星形胶质瘤细胞中，gdnf 基因启动子 II 区 Egr-1 结合位点区域组蛋白 H3K9 发生了高乙酰化修饰，并且 Egr-1 与之的结合能力也显著升高(P0.05);gdnf 基因的转录水平以及 Egr-1 与该基因启动子的结合能力，都随着 Egr-1 结合位点区域乙酰化水平的升高而增强(P0.05); 相似的， gdnf 基因的转录水平以及 Egr-1 与该基因启动子的结合量，也随着 Egr-1 结合位点区域乙酰化水平的降低而减少(P0.05)，表明 gdnf 基因启动子 II 区H3K9 高乙酰化能够通过上调 Egr-1 与之的结合促进胶质瘤细胞中该基因的高转录，为探讨胶质瘤细胞中 gdnf 基因异常高转录的机制提供了新的线索。
