1、肾小管上皮细胞钙通道与尿路结石形成的相关性研究摘 要(限400字)： 尿石症的病因未明，其发病率和复发率较高，防治措施令人不满意。设想某种病理因素使肾小管上皮细胞的钙通道部分或完全失活，肾小管对钙的重吸收减少，导致尿钙的排出增加，可能为尿路结石形成的机制。本实验在既有钙通道与高尿钙相关研究的基础上，进一步研究钙通道与尿路结石形成的相关性。通过制备Vit D缺乏实验动物模型，分别用免疫组化技术及荧光探针钙图像技术观察实验模型钙通道表达、钙离子分布的变化与尿路结石形成的关系；比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异，为寻找尿石症的病因提供实
2、验依据；通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，用全细胞膜片钳技术观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为制定尿石症的防治措施提供依据。关 键 词(用分号分开，最多5个)钙离子通道；肾结石；肾小管上皮细胞 报告正文（一）立项依据与研究内容1.项目的立项依据泌尿系结石是一个全球性的疾病，是我国最常见的泌尿外科疾病之一。由于当前尿石症的确切病因仍不十分清楚，导致其发病率居高不下，治疗后复发率也很高，预防措施并不令人满意。因此，对尿石症的病因研究具有重要的临床意义。尿石症的的发病因素包括遗传、环境、饮食、疾病和代谢等多个方面。其发生的机制历史上也
3、经过长期的探索，提出了各式各样的学说。如肾乳头钙化斑学说，基质模板上形成学说，结石首发于肾淋巴系统学说，尿液晶体胶体失衡学说及尿液的过饱和结晶和抑制物学说等。这些学说只在结石形成的某一片段或某一方面阐述结石的形成机制，而且部分机制还未得到全面、深入的研究。钙代谢异常是近年研究较多的引起尿路结石的重要因素之一。钙是泌尿系结石成分中最主要的阳离子，Daudon等对10617份泌尿系结石标本作红外光谱分析，发现86%的泌尿系结石含有草酸钙，80%含有磷酸钙。文献统计至少4050%的尿路结石患者合并高钙尿症。我们对84例复杂性肾结石标本进行结石化学成分分析，其中70例（83.3%）为含钙成分的混合结石
4、；而且发现至少19.3%(11/57)的小儿上尿路结石合并高钙尿症。物理化学研究表明，尿液中的草酸钙和磷酸钙的饱和度与尿钙的浓度有关，尿钙增高易于诱发或促进含钙尿路结石的形成。高钙尿症的病理生理机制的研究，包括甲状旁腺素的作用、高钙饮食、骨代谢异常、细胞因子的作用、遗传因素、钙通道或钙泵等方面。近年来人们对钙通道及钙的机体代谢进行了深入的研究：血清钙正常水平的维持依赖于肠道对钙的吸收、骨钙的释放、肾对钙的重吸收的调节作用。正常情况下，体内并不存在骨钙的过度释放或沉积过程。体内钙环境的正常维持实际上取决于肠道钙吸收和尿钙排泄的平衡关系。无论在肾脏和在肠道，钙可通过被动滤过和主动重吸收两种途径进入
5、细胞外液。而钙的主动重吸收由钙调激素包括1,25-二羟维生素D3和甲状旁腺素（PTH）进行调节。钙的主动吸收主要发生在近端小肠与肾的远曲小管（DCT）和集合管（CNT）。从细胞水平看, 钙的主动吸收过程分为三个步骤:1、钙离子通过管腔膜的钙通道（TRPV5/6）进入小肠或肾小管上皮细胞；2、在细胞内，钙离子与钙结合蛋白结合（包括钙结合蛋白D28K和/或D9K），弥散至基底膜侧；3、钙离子通过钠-钙交换（NCX1）和/或钙-ATP酶主动转运进入细胞间隙。管腔膜的钙通道（TRPV5/6）是钙主动吸收的主要限速步骤，对维持钙的体内平衡至关重要。2004年12月2005年12月，本课题组进行二羟吡啶在
6、实验小鼠草酸钙结石形成的抑制作用研究，发现钙通道兴奋剂二羟吡啶可明显抑制实验小鼠尿钙的排出及肾脏草酸钙结石的形成。研究离子通道功能最直接方法是用膜片钳技术直接测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电位的变化。膜片钳技术是利用一个玻璃吸管电极完成膜片或全细胞膜电位的监测、钳制和膜电流的记录，通过观测膜电流的变化来分析通道个体或群体的分子活动、探讨离子通道的特性。膜片钳技术的优点就是在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素，研究它们对通道功能的可能影响。通过研究，一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理；另一方面，分析各种
7、药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点，提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。分子生物学技术为离子通道的分子结构分析、基因克隆、功能表达研究提供了有力工具，对于编码离子通道亚单位的基因结构可采用基因定位克隆确定其染色体上的定位，用逆转录-聚合酶链反应、Northern杂交等明确其在器官组织中的分布，用Western杂交检测基因表达产物等。荧光探针钙图像技术为检测细胞内游离钙离子浓度提供了有效手段，常用的荧光探针有Fura-2/AM、Indo-1/AM、Fluo-3/AM、Calcium Green等，常用的检测仪器有双波长显微荧光光度计、激光扫描共聚焦显微镜等，目前国外Olympus、Ze
8、iss、Spex等公司已生产了测定细胞内游离钙离子的显微荧光装置。将离子浓度图像和膜片钳记录结合，同时进行光电联合检测，从离子产生的离子浓度、图像变化和电信号变化多个方面研究离子通道，将获得更多的离子通道功能信息。对获得性离子通道病，主要采取患者血清或提纯的免疫球蛋白被动转移或人工重组抗原主动转移于整体实验动物的免疫方法；或将传代细胞与患者血清或纯化的抗体共同培养，而后对其电生理改变进行检测。通过制备离子通道病研究模型，结合分子生物学、膜片钳记录、荧光探针钙图像分析、细胞内电生理记录、免疫组化等多种技术进行在体和离体实验研究，是目前离子通道病的主要研究策略。设想在某种因素（包括遗传、激素或饮食
9、因素）使肾小管上皮细胞钙通道部分或完全失活，导致肾小管对钙的重吸收减少，导致尿液钙的排出增加，可能成为高尿钙症和尿路结石形成的机制。本实验在既有钙通道与高尿钙相关研究的基础上，进一步研究钙通道与尿路结石形成的相关性。通过制备Vit D缺乏实验动物模型，分别用免疫组化技术及荧光探针钙图像技术观察实验模型钙通道的表达、钙离子分布的变化与尿路结石形成的关系；比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异，为寻找尿石症的病因提供实验依据；通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，用全细胞膜片钳技术观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物
10、电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为制定尿石症的防治措施提供依据。参考文献1、Evangelista C, Rizzo M, Capasso G. New concepts of tubular calcium transport in the kidney: clinical implications. G Ital Nefrol, 2004 ,21(1):5-15.2、 张泽,陈文忠,李逊,等. 大体积复杂性含钙肾结石晶体成分特点.广东医学,2004,3:33-36.3、 刘永达,袁坚,刘冠炤,等.小儿微创经皮肾输尿管镜取石术.中华小儿外科杂志,2005,26(4):189-191.4、
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18、 and cell-free membrane patches J.Pflegers Arch,1981,391:85.17、Neher E,Sadmann B.The patch clamp technique J.Sci Am,1992,266(3):44.2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究目标：探讨肾小管上皮细胞钙通道的表达与尿路结石形成的相关性,为寻找尿石症的病因和制定尿石症的防治措施提供依据。研究内容：、制备Vit D缺乏实验动物模型，观察实验模型尿路结石的形成情况、观察钙通道在肾单位的分布、测定肾小管上皮细胞内钙离子浓度、观察钙通道mRNA的表达水平及记录小管
19、膜内外钙离子电流的变化。、比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管上皮细胞钙通道的表达差异。3、通过体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为尿石症的防治提供依据。拟解决的关键问题：1、成功制备Vit D缺乏实验动物模型。2、用抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞3、熟悉运用荧光探针钙图像技术、免疫组化技术、全细胞膜片钳技术。4、体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养。3.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技
20、术等说明）研究方法：一、制备Vit D缺乏组及空白对照组实验动物模型，通过HE染色技术观察尿路结石的形成及肾单位的病理改变情况，通过免疫组化技术观察钙通道在肾单位的分布，通过Fluo 3/Am标记的分子探针技术测定肾小管上皮细胞内钙离子浓度，通过RT-PCR法观察钙通道mRNA的表达水平，通过全细胞膜片钳记录技术记录小管膜内外钙离子电流的变化。并比较两组各观察指标的差异。二、选取伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者，采用抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞，用RT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平，并比较三组的差异
21、。三、进行体外肾小管上皮细胞（HEK293）培养，通过全细胞膜片钳记录技术，观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变。技术路线：一、动物实验： 随机分为Vit D缺乏组和空白对照组选用SD大鼠40只分别予相应应饲料喂养8周断颈处死大鼠，取双肾供实验用HE染色观察肾脏病理与结石形成情况取左肾作病理切片免疫组化观察TPV5/6在肾脏的分布取右肾，抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管和集合管上皮细胞分子探针技术测定小管细胞内钙离子浓度RT-PCR测定小管TPV5/6的表达水平全细胞膜片钳记录小管细胞生物电改变二、临床试验：伴高钙尿的尿石症患者无尿石症的原发性
22、UPJ梗阻患者开放手术同时取小块肾组织抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞RT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平，并比较三组的差异无伴高钙尿的尿石症患者三、离体实验： 二羟吡啶组硫氮卓桐组人胚肾小管上皮细胞（HEK293）空白对照组全细胞膜片钳记录小管细胞三组因钙离子内流的生物电改变，并比较三组的差异实验方案：一、动物实验：1、实验动物及分组 由广州医学院实验动物中心提供,21天龄SD大鼠40只,雌雄各半,体重3452g，随机分成VitD缺乏组及对照组，每组20只。VitD缺乏组予喂纯净水和缺乏VitD饲料配方（%）:玉米粉76g，蛋清粉5g
23、，小麦麸质13g，碳酸钙5g，氯化钠1g（该配方经云南省科委检测不含VitD）。对照组予喂自来水和基础饲料配方（%）:玉米粉30g，麦麸35g，鱼粉8g，豆饼20g，酵母粉5g，骨粉1g，盐0.5g，蛋氨酸0.1g，VitD3 0.1g，多种维生素0.2g;含钙量达1.18%。动物置于避光室中，双鼠一笼喂养，自由进食，共喂养8周。断颈处死两组大鼠,取双侧肾脏供实验用。2、观察项目：2.1 观察肾结石情况：左肾用福尔马林液固定,石腊包埋,切薄片,半数切片留作2.4，其余常规HE染色,在偏光显微镜下结晶结石及肾脏组织改变,病理分级5级，两组比较用2检验。2.2 钙通道TPV5和TPV6肾脏免疫组化
24、表达：运用2.1方法制备石腊波片，参照Hirnet方法的免疫组化技术，比较两组TPV5和TPV6在肾单位各部位的分布差异。2.3 测定远曲小管上皮细胞（DCT）和集合管上皮细胞（CNT）内钙浓度：取右肾，参照Pizzonia的抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管和集合管上皮细胞，将细胞传代于直径35mm塑料培养皿中,待24小时细胞贴壁生长并用不含血清的1640培养基冲洗两遍,加入Fluo 3/Am分子探针(Fluo 3/Am)来源于美国分子探针),在37下温育30分钟,并再次用不含血清培养基冲洗12遍,立即在激光共聚焦扫描显微镜(Ultima212,Meridian公司产
25、品)下观察,每组随机取5个视野,计算细胞总数及总荧光值,取其平均值为平均细胞内钙浓度值,不同组的平均细胞内钙离子荧光强度值比较用秩和检验。2.4 RT-PCR法测定远曲小管和集合管钙通道mRNA表达水平: 取培养的对照组及VitD缺乏组远曲小管和集合管上皮细胞,用Trizol提取细胞总RNA,经紫外分光光度计分析A260/A280均为1.8以上;用supercript逆转录酶合成cDNA,用elongase酶混合液进行扩增。PCR产物经1%琼脂糖电泳,在GeL 1000凝胶成像系统上扫描,分别测1,2/与-actin条带的A比值。参照Yoichi等引物设计。计量资料数据采用 Xs表示,配对资料
26、采用t检验,组间比较采用方差分析。2.5 全细胞膜片钳记录：将两组原代培养的远曲小管上皮细胞放入恒温灌流槽内用台氏液灌流,选择表面光滑、搏动规律、频率中等的远曲小管上皮细胞作为实验对象。实验在35-37条件下完成。调节三维操纵器将电极压在细胞表面,稍施负压即可形成高阻抗封接,施加脉冲负压或给予短暂的电脉冲击穿膜片,即形成全细胞记录模式补偿电容电流和串联电阻后,通过膜片钳放大器(Axopatch200-A,美国)发放刺激冲动,激发的电信号经AgCl-Ag电极引导,放大器放大,由模数转换器转换为数字信号,储存于计算机硬盘中以备分析。数据采用 Xs表示,配对资料采用t检验。二、临床试验 1、试验分组
27、：A组为伴有高钙尿症的肾结石患者：术前尿液检查连续两个24小时尿钙大于0.1mmol/(kg24h);IVP提示单侧肾脏内3cm大小肾结石,且具备行肾盂肾实质切开取石术手术指征,同时不合并其他泌尿系疾病。B组为不伴有高钙血症的肾结石患者：术前尿液检查连续两个24小时尿钙小于0.1mmol/(kg24h);IVP提示单侧肾脏内3cm大小肾结石,且具备行肾盂肾实质切开取石术手术指征,同时不合并其他泌尿系疾病。C组为无合并泌尿系结石的的原发性UPJ梗阻患者:B超及IVP检查均排除泌尿系结石,按照吴阶平泌尿外科学第三版原发性UPJ梗阻的诊断标准进行诊断，具有开放手术解除梗阻手术指征。各10例。2、实验
28、方法：三种患者在开放手术治疗的同时取出小块肾组织，参照Pizzonia的抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取和培养远曲小管上皮细胞，参照2.3法RT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平，并比较三组的差异。计量资料数据采用 Xs表示,配对资料采用t检验,组间比较采用方差分析。三、离体实验：1、肾小管上皮细胞的选用：选用人胚肾小管上皮细胞（HEK293），于伯森生物科技股份有限公司购买。2、实验分组：(1)空白对照组：对培养的HEK293不作任何处理；(2)二羟吡啶组：加入二羟吡啶(终浓度9mol/L)至HEK293悬液；(3)硫氮卓桐组: 加入硫氮唑酮(终浓度9mol
29、/L)至HEK293悬液。3、全细胞膜片钳记录：方法同上，比较三组HEK293的ICa的平均电流密度差异。数据采用 Xs表示,配对资料采用t检验。可行性分析1、本研究是在钙道道深入研究的基础上进行肾小管上皮细胞钙通道与尿路结石形成的相关性研究，具有较强的理论指导和实践意义。2、本研究所应用的免疫组化技术、RT-PCR技术、抗Tamm-Horsfall蛋白免疫方法提取技术、全细胞膜片钳记录均为开展多年的成熟技术。3、本研究由Dept of Physiology University of Texas Southwestern Medical center at Dallas的教授提供理论咨询和技
30、术支持。4、我院其腔内泌尿外科技术处于国内领先地位，对尿石症的基础和临床研究积累较多的经验，而且可提供充足的病例供实验和临床研究。4.本项目的特色与创新之处。本项目通过制备Vit D缺乏组及空白对照组实验动物模型，通过HE染色技术观察尿路结石的形成及肾单位的病理改变情况，通过免疫组化技术观察钙通道在肾单位的分布，通过Fluo 3/Am标记的分子探针技术测定肾小管上皮细胞内钙离子浓度，通过RT-PCR法观察钙通道mRNA的表达水平，通过全细胞膜片钳记录技术记录小管膜内外钙离子电流的变化，观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离子生物电的改变，初步探讨泌尿系结石的形成机制.并为制定尿石症的防
31、治措施提供实验依据。5.年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）2006年5月2007年2月 取SD大鼠分别进行随机分组、饲养2007年3月2007年10月 分别进行HE染色、免疫组化技术、RT-PCR、细胞内钙浓度测定、全细胞膜片钳记录，同期按照分组标准收集临床试验病例标本 课题组赴美国Dept of Physiology University of Texas Southwestern Medical center at Dallas学习后期试验相关技术，共同开展本项研究 2007年11月2008年3月 抗Tamm-Horsfall蛋白法提取和培养远曲小管上皮细胞RT-PCR法测定TRPV5和TRPV6 mRNA的表达水平2008年4月2008年7月 选用人胚肾小管上皮细胞（HEK293）进行分组离体试验2008年8月2008年12月 整理实验数据，进行统计学分析，得出实验结论，发表相关论文，若有进展性发现申报科研成果。
