1、 光皮桦 BlKNOX 家族基因表达及互作机制分析第一章 文献综述1.1 酵母双杂交系统的研究进展随着分子生物学技术的发展，研究重点从结构基因过渡到基因所编码的蛋白质。蛋白质是生物体中生命活动的主要体现者，生物体中的绝大多数生命活动都是在各种蛋白质的参与下完成的。蛋白复合体或蛋白质间的相互作用在有机体细胞的生命活动中如细胞分裂、信号转导、抗原识别、蛋白质的运输、遗传信息的表达和调控等方面起重要的作用。目前用于研究蛋白质的方法主要有酵母双杂交、GSTpull-down、串联亲和纯化联合质谱分析、免疫共沉淀等。其中酵母双杂交是一种直接在酵母细胞体内研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，可用于寻找与靶
2、蛋白相互作用的新蛋白、检测蛋白与蛋白的相互作用、寻找调控蛋白相互作用的化合物，确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点，在蛋白质相互作用图谱的绘制以及研究疾病的发生机制和药物开发等不同领域中广泛应用。在原有酵母双杂交的基础上经过不断的改进与发展，衍生出酵母单杂交系统、反向杂交系统、三杂交系统等一系列相关技术，这些技术广泛应用于蛋白质与 RNA，蛋白质与 DNA，蛋白质分子间相互作用的研究。酵母双杂交系统是由 Fields 和 Song 在 1989 年研究真核生物中反式作用因子对基因转录调控中建立9，该系统是基于对酵母转录因子 GAL4 的性质研究之上。GAL4 是由两个功能上相互独立、结构可
3、以分开的结构域组成：一是位于 N 端 1-174 位氨基酸残基区段与 DNA 上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)结合的 DNA 结合结构域(binding domain,BD)；另一个是位于 C 端 768-881 位氨基酸残基区段转录激活结构域(activation domain,AD)组成。这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的，单独的 BD 虽然可以和 UAS 结合但并不引起转录，单独的 AD 不能与 UAS 结合，只有当 BD 与 AD 分别表达形成的融合蛋白发生相互作用，GAL4 转录因子才具有转录活性启动子下游基因的转录10-12。在
4、 GAL4 系统中，报告基因有 ADE2、HIS3 、LacZ 和 MEL1，通过营养缺陷筛选以及蓝白斑结果灵敏地来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用13。.1.2KNOX 相关基因的研究进展在生物的发育过程中同源异型盒基因编码的蛋白作为转录因子起重要的调节作用。从酵母、真菌到动植物，大量的同源异型盒基被分离出来，研究发现，同源异型盒蛋白在生物的形态建成中发挥着重要作用。KNOX 家族属于 TALE(three amino-acid loop extension)同源异型盒蛋白超家族，其编码的蛋白质是非典型的同源异型盒蛋白包括四个区域 MEINOX 域、GSE 域、ELK 域、HD 域。其
5、中 MEINOX 域包括 KNOXA 域和 KNOXB 域是位于 KNOX 蛋白的 N 端的约 100 个氨基酸长度的保守区域，KNOXA 域在 KNOX 基因异源表达产生表型变化的过程中起重要作用，同时可能对目的基因的转录起抑制作用，KNOXB 域对于二聚体的形成和转基因植株异常表型的产生有重要作用。GSE 域位于 MEINOX 域和 ELK 域之间，较小且保守程度不高，参与调控蛋白的稳定性19。ELK 域编码核定位信号，参与蛋白质之间的相互作用。HD 域位于 KNOX 蛋白的 C 端是典型的同源异型盒区，参与 DNA 的结合和同源二聚体的形成，包括 63 个氨基酸，在第 1 个螺旋与第 2
6、 个螺旋之间存在 3 个额外的氨基酸(P-Y-P)20-21。KNOX 基因分布广泛，几乎存在于所有的单子叶和双子叶植物中。基于序列的同源性，研究者将 KNOX 基因分为 KNOXI 和 KNOXII 两类。其中 KNOXI 在分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的关键基因，通过调控与器官发生相关的细胞分化，最终影响侧生器官的形态建成；KNOXII 的表达模式多样化，几乎在所有的组织中都有表达，研究表明 KNOXII 基因参与调控植物细胞壁的次生生长、同时在根和茎、种皮、心材等的发育过程中起重要的调控作用5-7,22-27。.第二章 光皮桦 BlKNOX 基因表达分析与诱饵载体构建2.1
7、 材料与方法2.1.1 实验材料1）光皮桦 5 个 KNOX cDNA 全长由本实验室其他成员提供，测序结果正确。2）Y2H、Y187 菌株来自 Clontech 公司。3）大肠杆菌 DH5 为本实验室保存。4）pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGBKT7-Lam、pGADT7-T 购自 Clontech 公司2.1.2 试剂HiFi Taq 酶，PCR buffer，dNTPs ，DNA 限制性内切酶，DNA LigationKit，琼脂粉，葡萄糖，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，二甲亚砜 DMSO），二甲基甲酰胺 DMF），PEG3350，LiAc，核酸凝胶回收试
8、剂盒，质粒 DNA 纯化试剂盒，氨苄青霉素粉末，DNA 纯化试剂盒，卡纳青霉素粉末，快速酶切酶等试剂均购自 TaKaRa。酵母质粒提取试剂盒购自 OMEGA 公司。In-Fusion HD Cloing Kit，X-Gal ，Aureobasidin AAbA），SD Minimalmedium， -Leu DO Supplment，-Trp DO Supplment，-Leu/-Trp DO Supplment，-Leu/-Trp /-His/-Ade DO Supplment 等试剂购自 Clontech 公司。.2.2 结果与分析基于转录组序列，以 cDNA 为模板，克隆光皮桦 KNOX
9、 基因，结果获得 5 个不同序列，分别命名为 BlKNOX1-BlKNOX5。采用 EditSeq 分析，结果显示 BlKNOX1-BlKNOX5 这 5 个基因的 ORF 长度分别为 927bp，858bp，960bp，1131bp 和 1362bp。通过 Blast 对分析光皮桦 KNOX 基因结构域进行分析，分析表明，这 5 个基因属于典型的 KNOX 基因家族，其编码的蛋白包含 KNOXA、KNOXB、ELK、HD 结构域，其中 KNOXA 域由 46 个氨基酸组成，KNOXB 域由约 66 个氨基酸组成，ELK 域由 23 个氨基酸组成，HD 域由 62 个氨基酸组成，且 HD 结构
10、域的保守性高于其它结构域图 2.1）。系统进化分析显示：BlKNOX1,3,4 属于 KNOX类，其中 BlKNOX4 聚类于 KNAT1 亚家族，与毛果杨的 PtKN1 亲缘关系最近。BlKNOX1,3 聚类于 KNAT2/6 亚家族，BlKNOX1 与毛果杨的 Pt570713 同源性最高， BlKNOX3 与毛果杨的 Pt658310 的亲缘关系最近；BlKNOX2,5 属于 KNOX类，其中光皮桦 BlKNOX2 聚类于 KNAT7 亚家族，与毛果杨 PtKNAT7 亲缘关系最近，BlKNOX5 聚类于 KNAT3/4/5 亚家族，与拟南芥 AtKNAT3 同源性最高图 2.2）。.第
11、三章 光皮桦酵母双杂交文库的构建.293.1 材料与方法 . 293.2 结果与分析 . 353.2.1 光皮桦各器官总 RNA 的提取. 353.2.2 光皮桦双链 cDNA 的合成及纯化 . 353.2.3 光皮桦酵母双杂交文库质量鉴定 . 353.3 讨论 . 36第四章 BlKNOXs 互作蛋白筛选与互作机制研究.384.1 材料与方法 . 384.2 结果与分析 . 454.2.1 酵母双杂交文库筛选的结果. 454.2.2 BlBELs 基因序列分析. 474.2.3 BlBELs 猎物载体的构建. 47 4.2.4 酵母双杂交系统鉴定 BlBELs 与 BlKNOXs 相互作用.
12、 484.2.5 BlBELs 和 BlKNOXs 及筛选酵母文库所得基因的表达分析 . 494.3 讨论 .53第五章 结论 .56第四章 BlKNOXs 互作蛋白筛选与互作机制研究4.1 材料与方法4.1.1 材料1）诱饵载体第二章中构建）2）光皮桦酵母双杂交文库来自本实验室制备第三章中构建）3）光皮桦各组织 RNA 由实验室其他成员提供4）光皮桦 7 个 BEL cDNA 全长由本实验室其他成员提供，最初被克隆在 pEASY-T1 载体上，测序结果正确5）Y2HGold、Y187 菌株、pGBKT7 质粒、pGADT7 质粒均来自 Clontech 公司6）大肠杆菌 DH5 为本实验室保
13、存4.1.2 仪器THERMO 公司的台式高速冷冻离心机；BTX 公司的电转化仪；AB 公司的 PCR 仪；上海上净公司的超净工作台；Tanon 公司的电泳仪；凝胶成像仪；太仓华利达公司的细菌摇床；上海博讯公司的生化培养箱。结论1.成功构建光皮桦酵母双杂交文库，检测结果表明：所构文库库容量高、多态性丰富达到建库要求。2.基于转录组序列采用 RACE 的方法从光皮桦(Betula luminifera H.Wink.)克隆到 5 个 KNOX 基因，命名为 BlKNOX1-BlKNOX5。序列分析显示 BlKNOX1,3,4 属于 KNOXI，BlKNOX2,5 属于 KNOXII。同时采用实时
14、定量 PCR 的方法对其进行了表达分析，结果表明 BlKNOX1,3,4 可能与木质部的发育有关，而 BlKNOX2,5 可能参与花序、叶以及芽的发育。3. 构建 BlKNOXs 的诱饵载体质粒包括 pGBKT7-BlKNOX1 、 pGBKT7-BlKNOX2、 pGBKT7-BlKNOX3、 pGBKT7-BlKNOX4、pGBKT7-BlKNOX5，并检测表达的蛋白在酵母细胞中对报告基因有无自激活作用。检测结果表明 pGBKT7-BlKNOX2,4,5 无自激活活性，而其余两个有自激活活性。4. 选取 pGBKT7-BlKNOX2 与光皮桦酵母文库进行双杂交，通过 AbA、X-Gal 和营养缺陷型培养基来筛选阳性克隆。提取 223 个阳性克隆的质粒并转化大肠杆菌扩繁后测序，并把测序结果在 NCBI 数据库中进行同源性比对，最终确定 25 个与其相互作用的蛋白，分别为转录调控因子、肽酶、壳多糖酶。这些结果为揭示光皮桦 KNOX 基因的功能与调控机制提供了基础。
