1、蛋白質體學Mapping protein modification系所：食科四姓名：林佳祺學號：488410081一般所知 polypeptides 在核糖體形成，經由 posttranslation 作用將 polypeptides 進行修飾(modification)，送出細胞到最後的分解，為蛋白質之生合成途徑。而大部分在生物體中的蛋白質都是呈現修飾狀態。由於蛋白質會經過修飾，因而增加研究的複雜性。在過去 50 年研究中，有方法來偵測蛋白質是否有被修飾，但無法得知蛋白質何處有被修飾，又因修飾位置的不同，而有不同的結果。在偵測蛋白質磷酸化位置有兩種方法使用最廣泛：(1)單株抗體，(2)定點突
2、變。但這兩種方法有兩個問題：(1)單株抗體專一性的問題，(2)使用定點突變無法確定氨基酸是否有改變。於是目前採用 MS 方法來分析蛋白質的修飾。而 MS 可測定 peptide 的質量及序列，也可提供有關 peptide 修飾的訊息，並藉由 MS data mining 和 software tools 等工具，可明確且加速鑑定於氨基酸序列層次上的蛋白質修飾。在許多實驗中，先將蛋白質進行 tryptic digestion 成許多小片段，再經過 MS 分析。而完整的蛋白質序列由 MS data 表現的範圍叫“coverage”。如分析 tryptic digest 100 個氨基酸蛋白質，而得
3、到 MS data 只相當於 60 個殘基，則會說只有 60% sequence coverage。為了確定蛋白質修飾，所有氨基酸都具有可能性，所以必須有所有peptides 之 MS data，即必須要有 100 % sequence coverage。 將蛋白質進行 tryptic digest，之後得到片段 1、4、7 之 MS-MS圖譜數據及序列(圖一 A)，然而磷酸化卻發生在片段 2 和 8，所以無法偵測到磷酸化的位置，而是發生在其它的片段上。若是得到片段2 和 8 之 MS-MS 圖譜數據及序列(圖一 B)，即可知道磷酸化的位置，所以 MS-MS 圖譜不僅能鑑定蛋白質，也能精確推斷
4、磷酸化的位置。由 MS data 來推斷磷酸化的位置使用 MALDI-TOF 得到混合片段的 MS-MS 圖譜，而這數據提供片段離子正確的質量測定，且質量測定反應出片段的氨基酸組成及修釋 (磷酸化) 的質量，因此 MALDI-TOF MS 分析可告知研究者那一片段為修飾的形式存在。例如：MALDI-TOF 分析含磷酸化片段和圖一、sequence coverage 於 posttranslational modification之影響。不含磷酸化片段之混合物，結果產生兩個訊息，一個較低 m/z 為不含磷酸化片段，另一比不含磷酸化片段之 m/z 值高 80 單位的為含磷酸化的片段。所以將 MAL
5、DI-TOF MS 分析和 peptide mass fingerprinting algorithms 及 software 組合起來，可用來鑑定修飾型式的蛋白質。但此方法只能偵測磷酸化在那一片段上，而無法明確的指出是在那一特殊的氨基酸上。例如：某一片段 GQSTSRHK 含有兩個 serines，在未修飾片段之 MS data 為 m/z 900.976，在修飾片段之 MS data 為 m/z 980.9558，則可知有一磷酸化，但不知是在兩個serines 中的那一個。所以為了知是那一個 serine 被磷酸化，則必須得到 MS-MS 光譜。LC-MS-MS 提供片段之 MS-MS 圖
6、譜，因此能知道序列的組成及修飾的位置。例如：VPQLEIVPNpSAEER 之 MS-MS 圖譜如圖二。圖二、VPQLEIVPNpSAEER之MS-MS圖譜圖二為M+2H 2+的 MS-MS 圖譜，有修飾之片段(m/z 831.2)比未修飾片段(m/z 791.4)高約 40 單位，則可推論有磷酸化的存在。圖譜含有 b-和 y-ion(圖三)，可提供序列訊息。根據圖二圖譜顯示 y-ion 改變開始於 y5 ion，從 y5 ion 以後之訊息都高於未修釋片約 80m/z，由此可反應出磷酸化的存在。所以可以藉由 b-和 y-ion 的改變來推斷有被修釋殘基的位置。圖三、C 端片段和 N 端片段之
7、圖譜(MS-MS of peptides)所以 LC-MS-MS 較 MALDI-TOF 及 peptide mass fingerprinting 好，因為 MS-MS 圖譜可提供片段序列的訊息(b-和 y-ion)及特殊修飾訊息。H2N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-COOHR1O R2 O R3 O R4 5 H H H H H H H -Y3 Y2 Y1 5b1 b2 b3 5 Mining MS-MS Data for modifications一旦得到有修飾片段的 MS-MS 圖譜，則可合理的推斷序列及修飾的位置。但在處理大量的 MS-MS 圖譜數據時，會使用數據簡化法(
8、data-reduction algorithms)及 software tools 來篩選符合修飾片段之 MS-MS scans 數據。而 Sequest program 允許使用者去具體指定一些於蛋白質中常見的、低分子量的修飾。例如：使用者可指定serines、threonines 和 tyrosine 於片段中可能會被磷酸化，再從 MS-MS 圖譜去分析。所以 Sequest 會和 MS-MS scans 執行 MS-MS data的相關性，看有無被修飾。第二個方法去測定蛋白質的修飾是用SALSA algorithm 分析 MS-MS 數據。許多片段修飾會引起 MS-MS圖譜特殊的特徵。
9、例如：磷酸化的 serine 和 threonine 殘基在 MS-MS中移去磷酸(98da)(圖二)，在光譜 98 單位處可觀察到。圖四 A 是未修釋 AVAGCAGAR 之 MS-MS 圖譜，圖四 B 為 S-carboxymethyl-AVAGCAGAR 之 MS-MS 圖譜。在兩片段中之 y1-y4 ions 有相同的 m/z 值。在未修飾片段中， y5 ion CAGAR+為 m/z 477，而在修飾片段 S-carboxymethyl-CAGAR+為 m/z 535，所以兩者差 58是符合 carboxymethyl 修飾。所以修飾片段之 y5-y8 ions 都比未修飾片段高 5
10、8 m/z 單位。圖四A是未修釋AVAGCAGAR之MS-MS圖譜477.0535.3477.0圖四 B 是 S-carboxymethyl-AVAGCAGAR 之 MS-MS 圖譜SALSA algorithm 看出 MS-MS 圖譜，表現在特殊的 amino acid motif。SALSA 產生“virtual ruler”，例如 AVAGCAGAR 片段，使用的“AGCAG”ruler 符合 AVAGCAGAR 片段的一部分，若在AVAGCAGAR 誘導 cysteine 殘基修飾，則 b-和 y-ion 改變分別在 y5和 b5 ion 開始，則結果是 ruler 會與修飾片段的 y
11、-ion 部分配對( 圖五)。圖五 A、運用 CACGA 序列“virtual ruler”去看 S-carboxymethyl- AVAGC*AGAR in high m/z y ions.圖五 B、運用 CACGA 序列“virtual ruler”去看 S-carboxymethyl- AVAGC*AGAR in low m/z y ions.如圖五 A 所示，當開始與最高的 y-ion (y7)排列，有 y7、y 6、y 5 ions與 ruler 配對，而 y2、 y3、y 4 ions 則不能與 ruler 配對，若當開始與最低的 y-ion (y2)排列，則有 y2、y 3、y
12、4 ions 能與 ruler 配對，而y7、y 6、y 5 ions 則不能與 ruler 配對，因此只有部分配對。 SALSA 將分配計分給部分配對的 MS-MS 圖譜，且其計分不會高達未修飾片段的 MS-MS 圖譜，除非 SALSA 鑑定 MS-MS 圖譜符合修飾的片段。而從 MS-MS 圖譜能推論序列及修飾的位置。所以 SALSA algorithm區分光譜的能力會呈現定序及修飾之特色上。 結合 Sequest 及 SALSA 去偵測蛋白質的 modificationsSequest 在已知氨基酸上發現可預測的修飾反應，如：phosphoserine，而 Sequest 會企圖與修飾片
13、段的光譜及未修飾序列之資料庫做連結。在 SALSA 中則是企圖找尋 MS-MS 圖譜，因為 MS-MS 圖譜會顯現一些可預測的特性，例如從 phosphoserine 或 phosphothreonine 失去一磷酸。若將 Sequest 及 SALSA 組合( 圖六)。一開始用 Sequest 分析數據可成功的與許多 MS-MS 圖譜(含有序列之資料庫)相互關聯。若有一些是修飾片段的 MS-MS 圖譜，則用Sequest 是不正確的鑑定。接下來執行 SALSA 去找尋序列的 motif，也鑑定未修飾片段的 MS-MS 圖譜，而 motif 的調查也能鑑定 MS-MS scans，因此會有片段質量的差異性，所以 Sequest 及 SALSA 組合能鑑定蛋白質及偵測修飾的位置。圖六、運用 LC-MS-MS、Sequest 和 SALSA 去鑑定蛋白質的組成及偵測蛋白質修飾的位置。參考文獻：1.Daniel C.Liebler. Mapping protein modification. Introduction to Proteomics.p167-184.
