1、 生物科学网（www.info-）个人论文设计题目：基因表达芯片分析乳腺癌患者唾液转录组 学生姓名： 孙明辉 学号： 20100*51 专业： 生物技术 指导教师： 张* 学 院： 生命科学学学院 论文（设计）内容介绍论文（设计）题 目基因表达芯片分析乳腺癌患者唾液转录组 选题时间完成时间论文（设计）字数7000关 键 词 唾液、生物标志物、RNA、基因表达芯片、乳腺癌论文（设计）题目的来源、理论和实践意义：随着社会的进步，文化生活水平的不断提高，人们对医学检查的要求也越来越高，要求无创、简便、快速的检查诊断方法。科学技术的发展，为建立无创检查的方法提供了可能。而唾液是一种复杂的混合物，不仅含
2、有各种蛋白质，还含有 DNA、RNA、脂肪酸以及各种微生物等。研究发现，血液中的各种DNA成分同样存在于唾液中，唾液能反映出血液中各种DNA水平的变化。因此，就有可能通过唾液的检测来进行疾病的诊断。近期，唾液标本受到广大研究者的普遍关注。与血清标本相比，唾液采集安全方便，无创伤，无血源性疾病传播的危险，患者无痛苦，易于接受。与尿液标本相比，唾液具有可实时采样的优点。唾液检测研究已经引起了人们极大的兴趣，并取得了一些初步成果，唾液检测得到广泛应用。论文（设计）的主要内容及创新点： 1）本实验首次应用新一代测序技术对乳腺癌患者唾液提取的RNA基因表达芯片并用先进的生物信息分析技术进行分析得出结论；
3、 2）依据患者唾液中具有共性的基因变异对乳腺癌进行早期诊断和分期分型的整合分析，目前国内外尚无相关报道； 3）本实验的实施和完成将为唾液中RNA中的基因表达图谱进行乳腺癌早期诊断提供直接的理论和实验根据，为深入探讨其作用机制和临床广泛应用奠定良好的基础。附：论文（设计）本人签名： 年 月 日 目录 摘要：3Abstract41.引言51.1 背景51.2 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array简介61.3 唾液检测的意义及优势：81.4 唾液组学101.4.1唾液基因组学101.4.2 唾液转录组学101.5市场需求及产业化前景：111.6主要创
4、新点、先进性：112.实验原理123. 实验步骤123.1 唾液收集的标准操作程序123.2 D-chip软件的使用134.实验结果134.1 D-chip结果：134.2 讨论及分析：14参考文献：14 基因表达芯片分析乳腺癌患者唾液转录组摘要：前期动物模型和临床研究均显示了乳腺癌与唾液基因表达图谱的相关性。本研究利用试剂盒提取唾液样品中的总RNA，通过全外显子表达芯片（Affymetrix GeneChip HumanExon1.0 STArray）首次对我国乳腺癌患者唾液转录组进行分析，并与健康对照样本进行比较，运用生物信息学软件进行分析（dChip），筛选乳腺癌患者特异的基因表达图谱，
5、为进一步的临床独立样本验证提供候选基因。关键词：唾液、生物标志物、RNA、基因表达芯片、乳腺癌 AbstractPrevious mouse model studies and clinical studies have shown the correlations between breast cancer onset and salivary gene expression profiles. In the current study, we extracted whole RNA from saliva and analyzed the transcriptomic variations
6、 in breast cancer patients and healthy controls using Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST Array. We analyzed the array data using dChip software and discovered a panel of genes with significantly altered expression level. The results of our study provided candidate gene biomarkers and paves the wa
7、y for large cohort clinical validations.1.引言 1.1 背景 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病之一，严重威胁着女性的生命和健康。中国2013年肿瘤登记年报显示我国女性恶性肿瘤发病前十位中乳腺癌（16.97%）高居榜首，而女性恶性肿瘤致死前十位中乳腺癌（8.35%）则列第五位，远低于肺癌（23.89%）。乳腺癌的高发凸显目前早期诊断生物标志物的潜力尚未完全发挥。乳腺癌发现得越早，治疗得越早，其治愈率就越高。研究乳腺癌及其相关因素，目的是寻找发病原因，提示高危因素，监护高危人群，以期作到三早(早发现、早诊断、早治疗)和干预控制，为乳腺癌的预防和治疗开辟新的
8、途径。现阶段，乳腺癌的检测、诊断和分期分型主要依赖临床和病理组织学评价。临床评价包括临床触诊和影像学测量。临床触诊受施诊医师临床经验等主观因素影响，评估容易出现偏差，且对较深病灶不易估计。乳腺X线钼靶（mammography，MG）是乳腺疾病筛查和乳腺癌早期发现和诊断的首选检查方法，但检查过程中难以避免导致部分患者产生疼痛，增加受试者的辐射，对腺体致密型患者敏感性较低；乳腺超声对大于7mm 的残余癌检测的灵敏度达100%6，与MG联合检查更提高了准确性，但一定程度上增加了假阳性率。病理学检查是临床诊断的金标准，但术前无法准确判断淋巴结转移状况, 粗针穿刺结果可能没有代表性, 也无法判断脉管瘤栓
9、情况，同时难以对疾病的变化过程进行实时监控。因此，寻找一种有效的生物标志物作为早期诊断、分期分型、药物靶点筛查及肿瘤预后的指标是当前研究的热点。乳腺癌是应用高通量基因表达分析和蛋白质组分析最深入的肿瘤之一。这些研究所确定的分子图谱已逐步揭示了乳腺癌的分子特征，并提供了可用于疾病预测和诊断预后的基因标志物。前期动物模型和临床研究均显示了乳腺癌与唾液基因表达图谱的相关性。这些研究不仅探讨了唾液分子标志物与乳腺癌发生、发展的关系和潜在机理，还通过欧美临床样本寻找和验证了早期乳腺癌检测的基因表达图谱。然而应用基因表达芯片对中国人乳腺癌患者来源的唾液样本进行转录组学分析的研究尚未有文献报道。本研究选取了
10、12对乳腺癌和健康对照唾液样本，利用试剂盒提取出样品唾液中的RNA，利用基因表达芯片技术对样本转录组进行分析（其中有一个乳腺癌患者的基因芯片由于操作原因未出结果），并运用生物信息学软件进行比较，分析乳腺癌患者唾液样本的基因表达图谱与正常对照的异同，进而筛选可用于早期检测的生物标志物。1.2 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array简介本次试验是国内首次运用Affymetrix公司的GeneChip Human Gene 1.0 ST Array基因表达芯片技术，GeneChip Human Gene 1.0 ST是最精简、同时也是最强有力的全转录组
11、研究工具，其具备常规基因表达谱芯片无法比拟的优势，其优势在于：l 真正的基因全长转录水平测定，而非常规基因表达谱芯片仅以3端序列表达量为基因表达量，检测的准确性非常高；l 不会遗漏3端外显子丢失的转录本，若基因产物的3端被剪切(这样的转录本在身体内达到了30%)，则用常规基因表达谱芯片无法检测，而本芯片将全面的展示该部分内容。l 不会遗漏新增加的3端外显子，有些基因在特定疾病状态或生理状态下，会在原有转录本的3端出现新的外显子，这预示新的基因产物产生；l 可以测定无poly-A尾的转录本，无poly-A尾的的基因转录产物将在常规基因表达谱芯片的检测策略下会丢失；l 可检测RNA降解样本中的基因
12、转录水平，这是任何一种常规基因表达谱芯片的无法检测的；l 哺乳动物中数万个基因可以表达出上千万的不同形式的蛋白，基因与其产物数量的严重偏差主要来源于基因转录时的可变剪切。l 相同的基因，在不同组织中经过可变剪切将产生完全不同结构的蛋白，这些蛋白发挥完全不同的功能，有完全不同的活性，从而决定组织和器官的功能；l 相同的基因，在同一组织中的不同时期，也会经过可变剪切，产生结构不同的蛋白，影响不同的生物进程；l 相同的基因，在不同的疾病状态下，可通过可变剪切，产生结构和功能差别很大的蛋白，导致信号通路的激活状态差异，从而导致疾病发生；l 相同的基因，被不同类型的环境因素作用，或者被同种环境因素的不同
13、剂量作用，同样可以通过可变剪切，产生结构差异很大蛋白，从而导致个体对环境的易感性不同；l 为此，利用GeneChip Human Gene 1.0 ST才可以真正研究基因在所有状态下不同产物的真正性质和数量，从而为深入研究疾病形成机制、个体与环境交互作用、疾病诊断、以及治疗靶点提供全面的转录水平景象。设计思想：l 该款芯片中覆盖了76万个探针，其中包括当前所有已研究透彻的2.9万已知基因，平均每个基因被26个探针覆盖，芯片探针序列覆盖99%的NCBI基因标准序列数据库(Refseq)。所有探针的信息来源为：l 基因组信息来源：UCSC hg18, NCBI Build 36l 转录本信息来源：
14、RefSeq, Ensembl and putative complete CDS GenBank transcripts GeneChip Human Gene 1.0 ST的探针包含在GeneChip Human Exon 1.0 ST 探针集中，主要为其中的已知基因部分。该芯片不但可以进行全基因表达分析，还可以最大化地分析出样本的基因剪切形式，以及基因的新剪切变异体。GeneChip Human Gene 1.0 ST可对全转录本进行如下两个水平分析：l 基因水平：定量基因表达程度。芯片上每个基因从5至3端平均覆盖26个探针，与全球任何一种基于常规基因。l 表达谱芯片相比，基因全长覆盖探
15、针的芯片策略，可以为基因表达水平提供更加灵敏的检测能力和统计学上更加稳定的检测结果。基因表达水平定量根据基因多个转录本累计表达量确定。1.3 唾液检测的意义及优势：随着社会的进步，文化生活水平的不断提高，人们对医学检查的要求也越来越高，要求无创、简便、快速的检查诊断方法。科学技术的发展，为建立无创检查的方法提供了可能。而唾液是一种复杂的混合物，不仅含有各种蛋白质，还含有 DNA、RNA、脂肪酸以及各种微生物等。研究发现，血液中的各种DNA成分同样存在于唾液中，唾液能反映出血液中各种DNA水平的变化。因此，就有可能通过唾液的检测来进行疾病的诊断。近期，唾液标本受到广大研究者的普遍关注。与血清标本
16、相比，唾液采集安全方便，无创伤，无血源性疾病传播的危险，患者无痛苦，易于接受。与尿液标本相比，唾液具有可实时采样的优点。唾液检测研究已经引起了人们极大的兴趣，并取得了一些初步成果，唾液检测得到广泛应用。 唾液是龈沟液、黏膜渗出液、唾液腺腺泡超渗液的混合体，储存了大量的人类和口腔微生物的基因信息，是系统性检测mRNA和蛋白质变化的重要物质。唾液中还含有口腔局部组织和身体其他部位感染微生物和病毒的RNA和DNA。唾液来源的DNA质量中等，大部分样本可检测到基因型，可被扩增和测序。唾液成分较血液相对简单，且唾液在口腔中经唾液腺不断分泌、更新，口腔黏膜细胞、唾液腺和口微生物的变化都可通过唾液mRNA和
17、蛋白质的分析检测到，从而反映某一阶段口腔或身体其他部位的相关变化。 通过非侵袭性的方式来评估健康状况以及早期诊断口腔和系统性疾病一直是国家健康促进组织和医疗机构追求的目标。唾液作为监测健康和疾病的新兴递质，近年来得到了越来越多的关注，在疾病早期诊断中具有明显的作用。唾液较易操控，不易凝结，消除了抗凝处理对检验结果的影响。同时，唾液采集具有非侵袭性，受试者基本无痛苦和不适，具有较高的可重复性，安全而廉价。 唾液可以作为人体健康状况的一面镜子，目前以唾液作为诊断用介质正引起越来越多学者的关注。唾液检测可以在多种环境下包括在路边进行并提供有价值的诊断信息。唾液已经用于HIV、HBV病毒 ，以及各种药
18、物如可卡因、酒精的检测。唾液检测的研究刚刚起步，有关检测的灵敏性、特异性、重复性以及与现有诊断标准的相关性还有待进一步完善。尽管如此，唾液仍是具有极大科研和临床潜力的生物液。随着唾液检测的研究工作的不断深入，其应用将会实现由疾病诊断到健康监控的转变。1.4 唾液组学1.4.1唾液基因组学人类的唾液DNA总质量为1.8128.4 mgL1，平均为21.6 mgL13。唾液DNA约有68%来自于宿主细胞，32%来自于口腔微生物或者病毒。口腔中脱落的黏膜上皮细胞是唾液中人类DNA的主要来源。唾液DNA的质量较高，研究发现，72%96%的唾液样本可进行基因分型，84%的基因可被扩增，67%的基因可被测
19、序。有人利用TaqMan探针技术测定出唾液中人类DNA的质量约为11.4 mgL-1，并于37 温度下保存了30多天的唾液样本中将线粒体DNA、Y-染色体单核苷酸多态性和染色体微卫星灶三种不同的基因标志物准确归类。这就说明，唾液DNA具有一定的稳定性，储存性能好，适于远程运输。有研究者发现，以适当的缓冲液保存唾液样本，即使在室温条件下保存1年以上，其DNA提取量也不会受到明显影响。这就说明，唾液可为基因组学研究提供良好的DNA来源。1.4.2 唾液转录组学 唾液RNA的总质量为（0.1080.023） mgL-1（6.63.6）mgL-1范围内，其中大部分是人类mRNA4。目前，在健康人群的唾
20、液中可以检出3 0006 400种mRNA，约占人类蛋白编码基因的28%。其中，约200种mRNA由不同个体所共有，构成了人类唾液转录组的核心；个体mRNA存在较多的重叠部分，约419和570个相同的转录本分别出现在90%和80%的个体中。单纯的腮腺唾液中也存在较高质量的RNA（3.61.5） mgL-1，但仅仅含有4 778个转录本，较全唾液少；在舌下腺、颌下腺、龈沟液和口腔脱落上皮细胞中也有一定质量的mRNA，转录本分别为1 831、1 543、2 689和3 142个，即mRNA存在于各种来源的唾液中。唾液微生物DNA约占唾液总DNA质量的32%，即在未经离心的唾液中存在着一定质量的非人
21、类基因。目前已知唾液RNA主要来源于微生物，但关于非人类RNA总质量的信息还有待研究。最近一项利用大规模平行测序的研究5，获取了人非刺激性唾液所有的基因序列信息。其中，20%25%的序列片段与人类的基因一致，约30%的序列片段与人类口腔微生物组数据库一致。研究还发现了4 000多个基因的表达，不同位点的基因表达揭示了唾液中转录本结构上的完整性。该研究说明，唾液转录组是一个很复杂的RNA网络结构。 核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）虽然在细胞中相当稳定，但mRNA却可能在数分钟内迅速降解。唾液中的mRNA主要来源于唾液腺、口腔黏膜上皮细胞和龈沟液等。唾液RNA通过与某些未知的大分子
22、相互作用，可在室温下保持稳定；但当加入Triton X表面活性剂后，其RNA会迅速降解。这些发现与当前的一些假说吻合，即由脂质包被的微囊为唾液mRNA从疾病位点到达口腔提供了重要保护。唾液中的脂质微囊包含了诸多未受侵袭的功能性mRNA，后者甚至可改变口腔细胞角质蛋白的表达模式，且扮演了物质运输的重要角色。上述研究揭示了功能性唾液组学研究的全新方向。1.5市场需求及产业化前景： 早期诊断对乳腺癌的积极有效治疗和长效预后至关重要，可以减少病人的痛苦和疾病相关的社会成本。中国人群在遗传、环境和生活方式等方面与欧美乳腺癌高发地区有显著的差异，发展以中国女性为研究对象的乳腺癌病因研究和生物标志物研究，不
23、仅能为中国女性乳腺癌危险因素的明确和预防控制提供科学依据，而且也能为解释乳腺癌人种分布的差异、更深入揭示乳腺癌的病因提供证据。1.6主要创新点、先进性： 1）本实验首次应用新一代测序技术对乳腺癌患者唾液提取的RNA基因表达芯片并用先进的生物信息分析技术进行分析得出结论； 2）依据患者唾液中具有共性的基因变异对乳腺癌进行早期诊断和分期分型的整合分析，目前国内外尚无相关报道； 3）本实验的实施和完成将为唾液中RNA中的基因表达图谱进行乳腺癌早期诊断提供直接的理论和实验根据，为深入探讨其作用机制和临床广泛应用奠定良好的基础。2.实验原理我们用Affymetrix公司的HG U133加2.0阵列分析1
24、2例乳腺癌患者唾液转录和12组对照样本的比较。实验组和对照组在年龄、吸烟史、绝经期状态及激素的分泌情况都尽量保持一致。对唾液转录组进行分析，看相对于健康对照组（n =12， P 2倍上调，多少个基因表现 2倍下调.。因为假阳性率P 0.05 ，所以这些转录鉴定不太可能归因于巧合（2检验，P 2倍，P值 2倍，P值 0.01的转录组，这些转录组就是我们要找的与乳腺癌相关的候选基因。参考文献：1. Hinestrosa, M.C., Dickersin, K., Klein, P., Mayer, M., Noss, K., Slamon, D., Sledge, G. and Visco, F.
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