1、,2016届第一轮复习之 选修1生物技术实践,绥德县第一中学 陕西省绥德,专题2 微生物的培养与应用,微生物的分离和培养 （培养基、灭菌、倒平板） 某种微生物数量的测定 培养基对微生物的选择作用 利用微生物发酵来产生特定的产物及微生物在其他方面的应用,通过本专题的学习，应当掌握培养基、消毒灭菌等有关微生物培养的基础知识，应当掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术，并可以运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数、微生物的分离与培养等实际问题。,课题1 微生物的实验室培养,了解培养基的用途、种类及一般成分， 掌握培养基制作的一般的步骤，学会一般的消毒、灭毒的方法，进行无菌技术的操
2、作。 掌握微生物分离中的划线法和涂布法。 体验微生物与现代生物技术之间的密切的关系。,一、基础知识微生物,（一）.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻等,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,真核藻类、原生生物,病毒、类病毒、朊病毒,特点：结构都相当简单，个体多数十分微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。,（如：草履虫、变形虫等）,1.细菌的形态,（1）球菌：球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌，葡萄球菌和链球菌。 （2）杆菌：短杆状、棒杆状、梭状、月亮状、分枝状。 （3）螺旋状：可分为弧菌（螺旋不满一环）和螺菌（螺旋满一
3、圈以上）,细菌,细菌主要是以二分裂的方式进行增殖,2.细菌的繁殖,3.细菌的菌落,.定义：菌落（colony）是由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,病毒的结构,吸附,注入,合成,释放,组装,病毒的繁殖,病毒的增殖一般可分五个阶段，即： 吸附注入核酸合成核酸和蛋白质组装释放,病毒的营养方式,：寄生,放线菌,放线菌因菌落呈放线
4、状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，事实上大多数抗生素（广泛应用的抗生素约70%）是各种放线菌所产生。（链霉素、土霉素、卡那霉素、庆大霉素、利福霉素、四环素等等） 土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。,真菌,真菌，是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母 真菌的异养方式有寄生和腐生。,原生生物,原生生物(protist / protoctists)大部分都是单细胞生物，比原核细胞更大、更复杂。有些原生生物可以利用光合作用制造食物，原生生
5、物界至少包含5万种的生物。 健康食品，如绿藻的绿胞藻 和连营藻 ，蓝绿藻的螺旋藻 等。 有些藻类可以食用 发菜，群带菜，紫菜、龙须菜和菩提藻,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）,例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类,光能自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,自养菌:分类异养菌:,70%以上的天
6、然抗生素均由土壤放线菌产生。如头孢拉定、链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素、春雷霉素、四环素、红霉素和卡那霉素等。,二、培养基的概念、种类及营养构成,1、概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。,2、培养基的分类,根据化学成分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基,根据培养基外观的物理状态 液体培养基 半固体培养基 固体培养基,根据培养基的功能 基础培养基 选择培养基 鉴别培养基,是指采用动植物组织或微生物细胞及它们的提取物或粗消化物配制而成的培养基。 优点：取材便利、营养丰富、配制简便 缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性差(成分不明确) 如牛肉膏蛋白胨培
7、养基、麦芽汁培养基等,天然培养基,合成培养基,是指由准确称量的分析纯等高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的培养基。 优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好 缺点：配制繁琐、成本较高 如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等,根据化学成分,半合成培养基,是指采用部分天然物质和部分化学试剂配制而成的培养基。 优点：兼有天然培养基和合成培养基的一些优点如马铃薯蔗糖培养基,根据培养基外观的物理状态,液体培养基：微生物或动植物细胞的液状培养基需要进行通气培养、振荡培养。这种培养基常用于鉴定菌种和计数。 半固体培养基：培养液中加入少量的凝固剂（琼脂）制成了半固体培养基。常用于观察细菌的运动、厌氧菌的分离和
8、菌种鉴定等 固体培养基：在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基，培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。,明胶是最早使用的固体培养基凝固剂,已逐渐被琼脂所代替.琼脂由于形成凝胶后透明度高、保水性好、无毒、不被微生物液化等优点,逐渐成为最常用的凝胶剂.后来,又发现无机硅胶、瓜尔胶、卡拉胶在某些情况下可用作凝固剂.近年来,兴起一种基于微生物快速检测的快速测试片,其所用凝固剂发展到黄原胶、刺槐豆角、聚丙烯酸系等.但新型凝固剂在使用过程中仍存在许多弊端,因此,从吸水和保水的机理出发对其研究和改性是一项重要的任务.,琼脂特性是它的凝点40和熔点95之间的温度相差很大，凝固之
9、前接种时，也不致将培养物烫死 。由于它是高分子化合物所以微生物不能利用。,基础培养基,基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细菌生长。基础培养基是配制特殊培养基的基础，也可作为一般培养基使用。 如在牛肉浸液中加入适量的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节 pH7.27.6，经灭菌处理后，即为基础液体培养基；如再加入0.3%0.5%的琼脂，则为基础半固体培养基；加入1%2%的琼脂，则为基础固体培养基。,根据培养基的功能,鉴别培养基,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如伊红和美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落带有金属光泽,可以用来鉴别大肠杆菌 大肠杆菌分解乳糖产
10、生大量混淆酸，可染上酸性伊红，伊红又和美蓝结合，菌落被染成深紫色，从菌落外貌的发射光中还可以看到绿色金属发光,选择培养基,选择培养基在培养基中加入某种化学物质或除去某些营养物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长 加链霉素 可抑制细菌和放线菌的生长,将真菌分离出来。（链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长,对酵母菌和霉菌不起作用.加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌. ） 加高浓度的食盐 抑制多种细菌生长,分离到金黄色葡萄球菌。 无氮培养基 可用以选择能固氮的细菌。 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物 加富培养基：是指在培养基成分的营养物质仅
11、适合一种或一类微生物，从而使此类生物生长繁殖较快淘汰其他微生物,3、培养基的成分,营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。,微生物的碳源 概念：能为微生物提供所需碳元素的营养物质 来源：无机碳源：CO2；NaHCO3等有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 作用：构成细胞物质和一些代谢产物异养微生物的能源,微生物的氮源 概念：能够为微生物提供N元素的营养物质。 来源：无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等 作用：主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,二、培养基的概念、种
12、类及营养构成,对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。,三、无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,化学药剂的消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。 体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强，浓度过低，杀菌力弱，浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形，成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，因此杀菌效果受影响。 微生
13、物的接种工具接种环、接种针或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,3.具体操作 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸管 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2
14、）需要灭菌；（3）需要消毒。,(1)计算：依据是培养基配方的比例。 (2)称量：牛肉膏比较黏稠，可同称量纸一块称取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。 (3)溶化：牛肉膏和称量纸+水加热取出称量纸加蛋白胨和氯化钠加琼脂（注意：要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂）补加蒸馏水至100mL。 (4)灭菌：将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min；培养皿可用干热灭菌。 (5)倒平板：待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素 蛋白胨主
15、要提供氮源和维生素。,四、实验操作(以培养大肠杆菌为例),（一）、制备牛肉膏蛋白胨培养基,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发（也有说防止水分过快散失）,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染.,
16、4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,倒平板操作,牛肉膏（Beef Extract）,又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备,蛋白胨peptone,蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成
17、的外观呈淡黄色的粉剂，蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类可用作微生物和动物细胞培养基,酵母浸膏,酵母浸膏（酵母膏）是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素。主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子。一般的用量为0.2%2.0%。,pH、温度、时间了解,最适pH 细菌：6.5-7.5 放线菌：7.5-8.5 真菌： 5.0-6.0 采用pH试纸测试，一般用3%的HCl或NaOH溶液调节,培养温度和时间 细菌：30-37 1-2d放线菌：25-28 5-7d真
18、菌：25-28 3-4d,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.07.2 灭菌 1.05kg/cm2， 2530min,马铃薯蔗糖琼脂培养基,用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基，其配方如下： 去皮马铃薯（或鲜豆芽 200g 蔗糖 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm2 20min,高氏一号培养基,用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5
19、g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g pH 7.47.6 琼脂 20g 自来水 1000mL灭菌： 1.05kg/cm2 30min,四、实验操作(以培养大肠杆菌为例),（二）、分离纯化大肠杆菌,通常把无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。 方法：微生物的接种的常用接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。,（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 （2）稀释涂布平板法：将骏业进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,（1）平板
20、划线操作：,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；同时存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,（二）、分离纯化大肠杆菌,方法：,（1）平板划线操作： 挑取他含菌样品： 选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 划A区： 将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划34条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖
21、上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。 划其他区： 将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。 等平板凝固后，将平板倒置。,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端
22、，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,划线
23、分离操作中的有关问题：,（1）在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。,（2）在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。 （3）在进行第二次以及其后的划线操作时要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（2）稀释涂布平板的操作方法,（二）、分离纯化大肠杆菌,方法：,（2）稀释涂布平板的操作方法,（二）、分离纯化大肠杆菌,方法：,（二）、分离纯化大肠杆菌,培养、鉴定： 将接种后的
24、培养基和一个未接种的培养基（对照组）都放入到37恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。,最适pH 细菌：6.5-7.5 放线菌：7.5-8.5 真菌： 5.0-6.0,培养温度和时间 细菌：30-37 1-2d 放线菌：25-28 5-7d 真菌：25-28 3-4d,菌种保存：,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,.长期保存：,甘油冷冻管藏法,.临时保藏：,进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培 养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则茵落中的细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温
25、培养时，培养皿必须倒置。 培养后判断是否有杂菌污染的方法 从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。 用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。,结果分析与评价,.培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 .接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要
26、求，需要分析原因，再次练习。 .是否进行了及时细致的观察与记录 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与纯化,1分离菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的筛选 依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。(2)实验室中目的菌株的筛选 原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度.pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的
27、氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。,（一）土壤中分解尿素的细菌的分离,2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,3、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基
28、,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基 有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,（二）统计菌落数目,微生物计数通常有：利用计数板直接计数（血球计数板显微镜）和利用菌落数间接计数,1、理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。,菌落数间接计数,2、原理：1个菌落1个活菌,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值，需培养计算出三个或三个以上的平板菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,3、注意事项,血球计数板直接计数不能区分死活,土壤取样样
29、品的稀释将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上挑选能生长的菌落鉴定,（二）实验流程,（1）土壤取样,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先灭菌过的信封中。,（2）制培养基,准备牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。选择较为宽泛的稀释范围，稀释倍数为103-107;每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基
30、；准备8个灭菌试管和1个灭菌移液管。,（3）样品稀释涂布,每个稀释度均用3个选择培养基。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/g）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性的提供选择培养的条件。,（4）微生物的培养与观察,最适pH 细菌：6.5-7.5 放线菌：7.5-8.5 真菌： 5.0-6.0,培养温度和时
31、间 细菌：30-37 1-2d放线菌：25-28 5-7d真菌：25-28 3-4d,注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生红色反应。,（5）细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30-300的平板进行计数。在同一稀释度下至少对3个平板进行重复计数，求出平均值，然后根据平板对应的稀释度计算样品中细菌的数目。 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释
32、操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,设置对照,目的 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响。 什么是对照实验？ 除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，称为对照实验。 通过书中的案例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设臵是必不可少的。,稀释涂布平板法：,涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过
33、滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,酚酞和酚红有什么区别,酚酞,酚红,酚红指示剂是由酚红所配制成的0.020.05%的醇溶液。当被测溶液的pH值小于6.8，则指示剂呈现黄色的酸性反应；若被测溶液的pH值大于8.4，则指示剂呈现红色的碱性反应酚酞是一种弱有机酸，在pH8.2的溶液里为无色的内酯式结构，当pH10时为粉红色的醌式结构，是一种常用的酸碱指示剂（变色范围pH值8.2-10.0，由无色变红色）。 酚酞的醌式或醌式酸盐，在碱性介质中很不稳定，它会慢慢地转化成无色羧酸盐式；遇到较浓的碱液，会立即转变成无色的羧酸盐式。所以，酚酞试
34、剂滴入浓碱液时，酚酞开始变红，很快红色退去变成无色。,课题3 分解纤维素的微生物的分离,一、纤维素与纤维素酶,纤维素（cellulose）是由葡萄糖组成的大分子多糖。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纤维素含量接近100%，为天然的最纯纤维素来源。植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中。 许多商品纤维素都是由天然纤维素制得:如水溶性的羧甲基纤维素钠(CMC-Na);不溶于水的微晶纤维素等食品添加剂。 纤维素是重要的造纸原料，此外广泛用于塑料、炸药、电工及科研器材等方面。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(
35、外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌。,纤维素酶的活性测定实验滤纸崩溃法,二、纤维素分解菌的筛选,纤维素分解菌的筛选方法 刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接 对微生物进行筛选,纤维素分解菌的筛选方法的原理,刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生
36、透明圈来筛选纤维素分解菌,三、实验设计,实验原理： 土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。 在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。,1、土壤取样,选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的
37、环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,2、选择培养*（此步可以省略）,选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。可用用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。,操作方法：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用,本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖，有选择作用
38、。,3、梯度稀释,按照课题1 的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106。,4、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的固体培养基上培养基上,1、制备培养基:参照旁栏中的比例。 2、涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养。,刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。,方法二：在倒平板时就加入刚果红。,缺点:是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发 生混杂； 优点:是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。,优点:是操作简便，不存在菌落混杂问题； 缺点:一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的
39、微生物出现假阳性反应； 缺点:二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。,5、挑选产生透明圈的菌落,参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈，从产生明显的透明圈的菌落上挑取部分细菌，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在3037条件下培养，可获得较纯的菌种。,由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离
40、纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落： 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 （二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,例1、(20分)某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：（北京卷）,(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选 ，这种培养基属于 培养基。,目的菌,选择,【例题解析】,(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的 ，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是 。,化合物A,异养需氧,(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量 的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量 。,减少,增加,(4)转为固体培养时，常采用 方法接种，获得单菌落后继续筛选。,平板划线,
