1、,上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制,哈尔滨医科大学附属三院 耿敬姝,上皮-间质转化 （epithelial-mesenchymal transformation,EMT）,EMT概念 对上皮间质转化概念的进一步重新被认识 近年成为肿瘤研究热点之一,EMT概念,EMT是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向具有移行能力的间充质细胞发生转化的现象。EMT是一种基本的生理病理现象，是胚胎发育中及形态发生过程中的重要组成部分。,对上皮间质转化概念的进一步重新被认识,多种生长因子和转录因子相关； 可以通过多种信号转导通路起作用； 在胚胎发育、损伤修复起重要的作用； 肿瘤的发生、发展中起着重
2、要的作用。,EMT的标志性变化,立方上皮失去细胞间相互作用；立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变，外形演变为纺锤形纤维细胞形态；上皮细胞表型丧失，从而获得间质细胞表型。,发生EMT后标志物变化-表达下调：,E-钙黏蛋白（E-cadherin） -连环素（-catenin） -连环素（-catenin） -连环素（- catenin） 桥粒斑蛋白 紧密连接蛋白(ZO-1) 角蛋白 黏蛋白等,发生EMT后标志物变化-表达上调,波形蛋白（Vimentin）、 纤维连接蛋白、 N一钙黏蛋白、 -SMA等,发生EMT后标志物变化-表达上调,Snail、Slug、Twist Rho 成纤维细胞特异蛋白(FSP
3、1 ) 转化细胞生长因子(TGF-） 成纤维细胞生长因子（FGF) 基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、-9(MMP-9) I型胶原、型胶原,上皮母细胞,EMT,中胚层的原始 间充质细胞,MET,次级上皮细胞,中胚层其他 结构细胞,内胚层其他 结构细胞,上皮间质转化,间充质细胞向上皮细胞转变,EMT与胚胎发育 在胚胎三胚层结构的形成中起作用,EMT,EMT调节着哺乳动物的胚胎发育,器官形成：与原肠胚、四肢以及肺、肾、胃、心等器官的形成有关。 胚层分化：EMT与体壁内胚层和中胚层的分化，以及定形内胚层的形成有关。 神经系统分化：EMT促进了背神经上皮细胞向神经管嵴细胞的转化，进一步引起背神经上皮细
4、胞向外周神经系统中的多种神经元细胞、神经胶质细胞、色素细胞以及心脏、面颊、颈部的结缔组织的分化。,EMT与肿瘤的侵袭转移,EMT在成年人中不会广泛存在，然而在肿瘤发生过程中，EMT 使得原本没有侵袭和迁移能力的细胞获得浸润转移的能力，最终转移到其他组织或器官。 众多的研究表明，EMT的发生过程是由细胞外的信号通过与细胞表面特异性受体结合而将信号转入细胞内，通过多种细胞内信号转导机制调控，如胞内的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt等信号转导途径，活化不同的核内转录因子，最终调解转导基因的表达。 EMT的发生是一个动态的过程，它涉及到许多生长因子及多个信号转导通路，各个通路间相互作用，相互影
5、响，形成一个复杂的网络系统。,肿瘤EMT的发生机制,生长因子在EMT中的作用 肝细胞生长因子（HGF） 表皮生长因子（EGF） 转化生长因子（TGF-） 血管内皮生长因子（VEGF）等可以诱导EMT发生，也可以引起细胞增殖，这取决于局部微环境与信号分子之间的作用。,络氨酸激酶,EGF受体,EGF,FGF受体,FGF,细 胞,细 胞,肿瘤EMT的发生机制,转录因子在EMT中的作用 Snail/Slug ：属于锌指蛋白Snail超家族，它们通过同Smad相互作用蛋白(SIP1)竞争性结合E-钙黏蛋白启动子区的E-box连接基序，抑制E-钙黏蛋白的表达以及诱导波形蛋白表达水平的上升，从而诱导EMT的
6、发生。Twist：属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白家族，是一个高度保守的转录因子，可以诱导EMT的发生, 调节胚胎发育中的组织重建，并赋予细胞迁徙能力。核因子-B（nuclear factor kappa B, NF-B）可与vimentin基因启动子调节序列结合，促进Twist表达，诱导EMT的发生，在EMT的发展和维持过程中，NF-B是必须的，抑制NF-B可以阻止EMT的发生，相反的，激活NF-B则可促进上皮细胞向间质细胞发生转变。,诱导EMT的信号通路,TGF-信号通路 受体络氨酸激酶Ras-MAPK通路 Src激酶通路 Wnt信号通路 P13K/AKT途径 Rho信号通路,诱导EMT的信号通
7、路,TGF-信号通路胞外信号可以诱导上皮细胞发生EMT。这些细胞外信号包括细胞外基质分子(胶原，可溶性因子如上皮细胞生长因子EGF、转化生长因子TGF-、胰岛素样生长因子IGF、成纤维细胞生长因子FGF、肝细胞生长因子HGF等)，均能诱发肿瘤细胞内的信号级联反应，促进EMT的发生。TGF-主要通过各整合素信号传导途径发挥作用，促进Smad3分子依赖的细胞转录过程，也可以通过非Smad分子依赖的P38MAP激酶途径及GTP酶介导的信号转导途径发挥作用。根据组织类型的不同，三种TGF-均可参与EMT的诱导机制。特别注意的是TGF-在肿瘤中扮演着双重角色:一方面，它作为一种肿瘤生长抑制因子，能抑制原
8、位肿瘤细胞的增殖，诱发衰老和凋亡来阻止肿瘤的生长;另一方面，在肿瘤的侵袭和转移过程中，TGF-却扮演着肿瘤生长促进因子的角色，不但促使细胞周期阻滞，加速凋亡，还能诱导维持EMT状态。,诱导EMT的信号通路,受体络氨酸激酶Ras-MAPK通路受体络氨酸激酶是一类小GTP结合蛋白超家族，共包括6个成员：Ras、Rab、Ran、Rho和Rad/Gem/Kir(RGK)，它是一类具有络氨酸激酶活性的受体，激活后通过一系列蛋白使G蛋白Ras或MEKKs等激酶活化，由此将细胞外信号转入核内，通过级联反应起MAPK途径的激活。MAPK参与到很多生物反应的调节中，包括细胞增殖，整合素介导的细胞黏附，细胞分泌作
9、用，神经元分化，卵母细胞成熟，B、T细胞分化，以及细胞扩散。在Ras效应物中，丝氨酸/苏氨酸酶Raf信号反作用于TGF-的生长抑制和诱导凋亡的作用，强化TGF-的致侵袭效应。另外，MAPK家族中的JNK和P138磷酸化也影响细胞的表型转化。,诱导EMT的信号通路,Src激酶通路Src是一种原癌基因，属于非受体络氨酸激酶家族，主要调节与形态发生有关的许多生物功能，包括上皮细胞极性，细胞间黏附及恶性表型的形成。除此之外，Src家族还与EGF和集落刺激因子诱导的有丝分裂过程有关。Src家族激酶至少包括9个成员，每个成员都含有一个SH2和一个SH3结构域。SH2在信号转到中扮演重要的角色，而SH3在细
10、胞骨架重建方面有重要的意义。其中Src、Fyn、Yes在大多数组织中都有表达，而其余成员在特定的组织选择性表达。在结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中发现Src的异常激活和肿瘤的侵袭转移有关。,诱导EMT的信号通路,Wnt信号通路高度保守的Wnt/-连环素途径在胚胎发育和肿瘤中起重要作用。它由Wnt蛋白、卷曲蛋白、散乱蛋白、APC复合物、连环素、TCF/LEF转录因子家族组成。Wnt结合卷曲蛋白受体后，散乱蛋白被磷酸化激活，并与Axin发生直接作用，APC复合体解体，GSK-3无法磷酸化-连环素，从而阻止-连环素降解。当-连环素积聚到一定水平时，直接进入细胞核，与转录受体TCF/LEF结合，促进靶基
11、因的表达.。当-连环素的酪氨酸磷酸化后即与Caderin-CateninCompex (CCC)分离，由于上皮钙黏蛋白失去与连环素的锚连接而形成一种“活动”形式，因而从细胞内连接处重分布到别的区域，失去黏附功能，导致细胞分散增加，移动力加强和发生侵袭。,诱导EMT的信号通路,P13K/AKT途径PI3K和AKT是促进抗细胞凋亡的重要调节因子。 AKT一旦被激活便可以介导很多靶基因的活化和抑制，从而影响细胞的生存、生长、增殖、细胞骨架的构成等。它涉及细胞周期、细胞增殖、细胞存活、新陈代谢和EMT。EMT被活化的AKT诱发引起一系列的改变: (1)细胞黏附的丢失;(2)形态学的改变;(3)极性消失
12、;(4)细胞运动能力诱发;(5)细胞黏附力下降;(6)特殊蛋白质产物或分布的改变，如desmoplakin等。,诱导EMT的信号通路,Rho信号通路Rho家族是诱导张力纤维形成、调控细胞骨架蛋白、细胞黏附和细胞能动性的主要分子目前已离出16种，众多研究集中在Cdc42、Racl和RhoA。Cdc42促进成纤维细胞丝状伪足的形成，Racl则能调节层状伪足的生成及膜皱缩，RhoA可以促进张力纤维的装配。IQGAP是Rho家族的效应物之一，它直接与-cat及E-cad的胞浆部分互相作用，将其连接在肌动蛋白骨架上。IQGAP的-cat结合区域有部分与-cat结合区域相重叠，因此可以导致-cat从cat
13、-cat复合物上分离下来，引起与肌动蛋白骨架连接的断裂，细胞黏附力下降，运动能力增强。,EMT的分子机制,EMT在肿瘤中作用的研究进展,肿瘤的转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，大多数癌症患者并非死于原发性肿瘤而死于转移癌。目前已知肿瘤侵袭转移能力有赖于肿瘤细胞和促进肿瘤细胞生长、生成、血管生成、侵袭、转移等内环境因素的相互作用，其中EMT是肿瘤侵袭转移的主要因素之一。,在恶性肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞在生物学上表现出一定的异质性，其浸润区较瘤体中央的细胞更反映出肿瘤的生物学行为，具有比瘤体中央区细胞更强的运动力和侵袭性。许多国内外的科学家，经过大量研究证实，在包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝
14、癌、及宫颈癌等多种肿瘤侵袭转移过程中均观察到EMT的发生，而且肿瘤组织中发生EMT的瘤细胞数目直接与病变组织的侵袭转移程度相关。EMT可能在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，是启动恶性肿瘤侵袭转移的重要途径之一，还有许多临床病理研究均支持这一观点。,EMT在肿瘤中作用的研究进展,小结,EMT在胚胎发育时期的组织器官形成、成体后组织改建、创伤修复中发挥着重要的作用，同时在慢性病的发生，尤其是肿瘤的侵袭转移中的作用也备受关注。恶性肿瘤是一个动态发展的过程，不仅包括了基因的改变，还有肿瘤微环境的调节。EMT的发生能够使得连接紧密的上皮细胞获得迁徙能力，成为易于游走的间质细胞，到达靶器官后再通过间质-
15、上皮转化（MET）形成与原发灶相同的肿瘤，成为转移性癌。鉴于EMT在原发性肿瘤细胞迁徙到循环系统或淋巴系统中扮演着重要的角色，研究EMT的发生机制以及其调节因素在肿瘤的生长、逃逸、转移中的作用，及如何阻断这一机制的发生就显得尤为重要。,问题,1 什么是上皮间质转化？ 2 发生上皮间质转化的标志性变化？ 3 上皮间质转化时发生变化的标志物有哪些？,转录因子Twist调控胃腺癌细胞转移、 增殖及抗凋亡能力的分子机制,研究背景,bHLH domain,研究背景,研究背景,Twist及EMT相关分子的临床意义,Twist,E-cadherin,Vimentin,胃癌,技术路线,筛选细胞系,技术路线,实
16、验材料,Twist对胃腺癌细胞转移、增殖和活力的影响,结 果,Twist及标记分子在4个胃腺癌细胞系中的表达水平,结 果,结果,4个胃腺癌细胞系表型及形态比较,4个胃腺癌细胞系表型及转移能力比较,结果,胃腺癌细胞系中Twist过表达引起的效应,结果,胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应,结果,结果,胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应,0 hour 12 hours 24 hours,结果,胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应,结果,ShScramble,ShTWIST1,ShTWIST2,胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应,结果,胃腺癌细胞系中Twist表达
17、沉默所引起的效应,结果,胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应,Twist表达水平对p53蛋白的影响-Twist降低p53蛋白和mRNA在细胞内的水平,结果,Twist调控表达谱的鉴定,结果,Twist表达抑制前后HGC-27细胞的肿瘤相关基因表达谱,结果,胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱,结果,胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱,总结,四种胃腺癌细胞系中的Twist表达水平与细胞的转移能力及EMT相关分子的表达水平存在对应关系；,Twist表达抑制时，细胞出现与EMT相反的形态学改变；,改变胃腺癌细胞系中Twist表达水平，能够显著改变细胞的侵袭能力,改变
18、胃腺癌细胞系中Twist表达水平，细胞中各种EMT相关分子标记的表达发生明显改变 。,1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制,总结,1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制,EMT相关蛋白是Twist促进胃腺癌细胞转移的主要效应分子,1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制,总结,cell adhesion cell invasion cell migration,讨论,2. Twist参与调控细胞增殖及凋亡的机制,Twist表达抑制引起细胞周期捕获；,Twist表达水平改变显著影响胃腺癌细胞的存活能力；,Twist表达水平改变显著影响胃腺癌细胞中p53蛋白的含量；,讨论,2.
19、Twist参与调控细胞增殖及凋亡的机制,Nuclear transportation,讨论,2. Twist参与调控细胞增殖及凋亡的机制,结论,1. 胃腺癌细胞的侵袭能力受到Twist表达水平的重要影响，深入研究提示Twist通过EMT相关分子、p53和Akt信号通路促进胃腺癌细胞的转移； 2. Twist能够增强胃腺癌细胞的增殖和生存能力，深入研究提示Twist通过调控细胞内p53和Akt2的水平而实现上述功能； 3. Twist在胃腺癌细胞中至少通过3个水平来同时调控p53的水平，即直接的转录抑制p53基因、转录抑制ARF基因、以及转录激活AKT2基因； 4.本研究首次在Twist表达沉默的胃腺癌细胞中，确认8个基因的转录发生明显上调，另有6个基因显著下调。这些发现为胃腺癌的发生、转移和进展机制研究提供了新的线索。,展望！,2010年国家自然科学基金：Twist及相关蛋白AKRIC1、NF1调控胃腺癌细胞增殖、转移能力的机制研究,
