1、第五章 分子生物学研究方法（上）DNA、RNA 及蛋白质操作技术5.1 重组 DNA 技术重组 DNA 技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。重组 DNA 技术一般包括四步：获得目的基因；与克隆载体连接，形成新的重组 DNA 分子；用重组 DNA 分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定。特点：不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。适用于获取目标基因的表达产物。5.2 DNA 基本操作技术（1）核酸凝胶电泳技术将某种分子放到特定的电场中，
2、它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等） 。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA 和 RNA 实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将 DNA、RNA 放到电场中，它就会由负极正极移动。适用于 DNA、RNA 片段的分离。缺点：紫外对 DNA 分子有损伤，染料毒性大。（2）细菌转化与目标 DNA 分子的增殖细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的 DNA 而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化 DNA
3、 的菌株叫做供体菌株，接受转化DNA 的细菌菌株被称做受体菌株。常用的方法：CaCl2 法和电击法大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化 DNA 之前,必须先用CaCl2 处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态(Competent Cells)，Mg2+对维持外源DNA 的稳定性起重要作用。转化载体上一般带有 LacZ 基因，常用带有不同抗生素的选择性培养基结合 -互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。（3）聚合酶链反应技术用于体外快速扩增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。反应体系：模板 DNA、PCR 引物、四种核苷酸、Mg2+ 、TaqDNA 聚合酶、缓冲液和超纯水。反应过程：DNA 解链（变性）
4、 、引物和模板相结合（退火）和 DNA 合成（链的延伸）特点：敏感，特异，快速的核酸分析技术（4）实时定量 PCR荧光定量 PCR 是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。适用于对目标 DNA 片段初始浓度的定量分析。优点：与常规 PCR 相比，其特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等缺点：实验成本较高，影响因素较多，在定量丰度低的不可培养微生物时，其准确性不强。（5）基因组 DNA 文库构建把某种生物的基因组 DNA 切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形
5、成克隆，汇集这些克隆的总汇称为基因组 DNA 文库。可用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。常用 噬菌体载体，简单快速、易于操作。5.3 RNA 基本操作技术（1）总 RNA 的提取总 RNA 包括 mRNA、rRNA、tRNA 和一些小 RNA（sRNA）总 RNA 抽提方法很多，常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法。RNA 的浓度和纯度可以通过测定 OD260/OD280 来判定，1.8-2.0 在表示提取的 RNA 纯度较好。在变性的条件下进行 RNA 的电泳，甲醛是常用的变性剂，电泳后如果rRNA 大小完整，而且 28SrRN
6、A 和 18SrRNA 亮度接近 2:1，mRNA 分布均匀，则认为 RNA 质量较好。（2）mRNA 的纯化真核细胞的 mRNA 分子结构特征是具有 5端帽子结构 -m7G 和 3端的polyA 尾巴。实验常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度 mRNA。就是利用mRNA3端 polyA 的特点。mRNA 在高盐缓冲液下会特异性结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱 mRNA。目前许多商业化的试剂盒可用于 mRNA 的纯化，如 Promega 公司的polyAT Tract mRNA 分离系统将生物素标记的寡聚 dT 引物与细胞总 RNA 温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合 pol
7、yA mRNA，通过磁场吸附作用将polyA mRNA 从总 RNA 中分离。（3）cDNA 的合成cDNA 的合成包括第一链和第二链 cDNA 的合成。第一链是以 mRNA 为模板。有反转录酶（oligo dT）催化反转录成 cDNA。第二链的合成是以第一链为模板，由聚合酶催化合成。反应体系中加入甲基化 dCTP，保证新和成的 cDNA 链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。一般合成的 cDNA 双链 5端和 3端分别具有 Eco RI 和 Xho I 粘性末端，保证它与载体相连时有方向性。（4）cDNA 文库的构建常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足 cDNA 文库的要求，载
8、体的选择要根据该文库的用途来确定。常用的载体是 Uni-zap XR 载体。文库的构建可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。cDNA 文库的特点：基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性、不均匀性和各 cDNA 均可获得表达缺点：包含的遗传信息少于基因组 DNA 文库，并受细胞来源和发育期的影响；cDNA 能反映 mRNA 分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构和功能方面的信息；低丰度 mRNA的 cDNA 克隆难于分离。（5）基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA 分子的特定克隆
9、过程。核酸杂交法用放射性标记的特异 DNA 探针适用于高密度的菌落杂交筛选。特点：适用性广泛、快速。PCR 筛选法适用于已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。特点：通用性强、操作简单。免疫筛选法适用于表达文库的筛选。特点：基于抗原抗体结合原理，操作简单。5.4 SNP 理论与应用SNP（单核苷酸多态性）指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。染色体 DNA 同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。根据 SNP 在基因组中的分布位置：同义 cSNP：不影响氨基酸序列。基因编码区 SNP（cSNP） 非同义 cSNP
10、：改变碱基序列。SNP 分为 基因调控区 SNP（pSNP ）基因间随机非编码区 SNP（rSNP）SNP 检测技术：基因芯片技术优点：高通量，一次可对多个 SNP 进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。缺点：芯片设计成本高，由于 DNA 样品的复杂性，有些 SNP 不能被检出。Taqman 技术优点：操作简单。可自动化。缺点：不能高通量分析，荧光探针费用高。分子信标技术与 Taqman 技术相似，也是在 PCR 体系中加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过检测荧光值的变化进行基因分型。优点是操作简单，课自动化；缺点是探针费用高，不能高通量分析。焦磷酸测序法适用于已知序列的 DNA
11、片段进行验证分析，已知 SNP 的序列验证及基因分型。优点：自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模 SNP 研究及基因分型。缺点：能读取的 DNA 长度有限。5.5 基因克隆技术在分子生物学中，人们把将外源 DNA 插入具有复制能力的载体 DNA 中，使之得以永久保存和复制的过程称为克隆RACE 技术适用于扩增已知 cDNA 序列的基础上克隆 5端或 3端缺失序列。优点：简单、快速、廉价等缺点：很大程度上依赖于 RNA 连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增。应用 cDNA 差示分析法克隆基因适用于在没有探针的情况下克隆控制某一特定性状或生理反应中间步骤的基因。优点：快速简便。m
12、RNA 用量少，大大降低了假阳性率， PCR 产物特异性较高，cDNA 片段的纯度较高。Gateway 大规模克隆技术利用 噬菌体进行位点特异性 DNA 片段重组，实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。优点：克隆重组率高；简单快速，可自动化；保持阅读框和方向；一次实验可以转移一个或多个基因到一个或多个表达载体。基因的图位克隆法适用于分离未知性状目的基因特点：无需预先知道基因的 DNA 顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。需要构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的 RFLP 或 RAPD 分子标记。5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术（1）双向电泳技术用于分离大量混合蛋白质组。优点：操作方便，可自动化。缺点：低拷贝蛋白的检测受限；难于分离极酸或极碱蛋白以及分子量极大或极小蛋白；难溶蛋白的检测较困难；技术要求较高。（2）蛋白质印迹法用于检测样品中是否存在蛋白抗原、基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断。优点：高效、简便、灵敏等。（3）蛋白质的质谱分析技术用于鉴定不同的蛋白质，特别适合于对未知肽的检测。优点：灵敏度高、分辨率高、需要的样品量少、快速，信息量大缺点：实验成本高，难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题。
