1、黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 学士学位毕业论文猪丹毒杆菌的病原分离鉴定及药敏试验学生姓名：李白学 号：20074032142指导教师：周玉龙 所在学院：动物科技学院专 业：动物医学中 国 大 庆2011 年 1 月黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 猪丹毒杆菌的病原分离鉴定及药敏试验摘要：2007 年 11 月 10 日，黑龙江省大庆市肇州县某猪场爆发传染病，110 头猪以急性败血为特征，死亡及淘汰率达 21.8%。养殖户把病猪送到黑龙江八一农垦大学动物医院剖检。主要剖检变化：皮下出血、下颌淋巴结肿大，腹腔积液，心肌出血，肝脏充出血，呈红棕色，脾出血肿大，肾脏出血并有坏死灶，胃肠粘膜出血并有溃疡
2、等。经实验室染色镜检，该细菌为革兰氏阳性成不分支的长丝状菌。生化试验结果显示此菌为猪丹毒杆菌，经动物实验证实该菌为致病菌，进而确定该猪场为猪丹毒杆菌病，药敏试验对青霉素 G、氨苄西林 和头孢噻吩等高度敏感。结合实际情况提出有效的防治方法。关键词：猪丹毒杆菌；急性败血；病原；鉴定；防治Abstract:November 10, 2007, Daqing City, Heilongjiang Province, Zhao Zhouxian outbreak of a pig farm, 110 pigs with acute septicemia is characterized by death
3、 and the elimination rate of 21.8%. The pigs to the farmers of Heilongjiang August First Land Reclamation University Animal Hospital planing inspection. The main pathological change: subcutaneous bleeding, jaw swollen lymph nodes, ascites, bleeding heart, liver filling bleeding, reddish brown, swoll
4、en spleen hemorrhage, renal hemorrhage and necrotic lesions, gastrointestinal bleeding and ulcers and so on. Biochemical test results showed the bacteria to swine erysipelas bacilli，The animal experiments confirmed that the strain is pathogenic, and to determine the erysipelas bacteria of the pig di
5、sease, susceptibility testing to penicillin G, ampicillin and other highly sensitive cefalotin. With the actual situation of effective control methods.Keywords: Pig erysipelas bacillus, Acute defeated blood, Pathogen, Appraisal; prevention 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 目 录前 言 11 材料与方法 11.1 试验 材料 11.2 试验方法 12 实验结果
6、 22.1 流行病学调查 22.2 剖检病变观察结果 32.3 细菌分离培养结果 32.4 生化试验结果 32.5 药敏试验结果 42.6 动物实验结果 42.7 确诊结果 43 小结与讨论 4参考文献 6致 谢 7附 录 8黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 1 -前言猪丹毒(swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌(红斑丹毒丝菌， E.rhusiopathiae)引起的一种传染病， E.rhusiopathiae 是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，属胞内寄生繁殖菌 1，E.rhusiopathiae 是人兽共患传染病。人感染后可引发类丹毒病症，主要对皮肤造成损伤。 2 不同年龄猪均有易感性
7、，但以 3 个月以上的生长猪发病率最高， 3 个月以下和 3 年以上的猪很少发病。牛、羊、马、鼠类、家禽及野鸟等也可发病，但非常少见。 7猪丹毒的流行无明显季节性，但夏季发生较多，冬、春只有散发。猪丹毒经常在一定的地方发生，呈地方性流行或散发。大约 30%-50%的健康猪都携带此菌，并通过粪便和口鼻分泌物感染其它动物，该病呈世界性分布，是欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆一种重要的经济损失性疾病。1,2,3其损失包括发病动物死亡、生长速度减慢。猪丹毒杆菌感染引起猪的急性或者亚急性败血症和慢性增生性病变，有时还可引起母猪流产和小猪腹泻 4,5,62010 年 11 月 10 日，黑龙江省大庆市肇源一养殖
8、户送检猪 2 头，为急性死亡病例，根据细菌分离培养、细菌生化微量鉴定确诊为猪丹毒杆菌，结合流行病学、临床症状、病理变化等综合确诊为猪丹毒杆菌感染。通过药敏试验确定该菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩高度敏感，对病畜应用高敏药物治疗，使疾病得到了及时的控制，从而降低了养殖户的经济损失。现将该病的分离与鉴定报告如下。1 材料与方法1.1 实验材料1.11 病料黑龙江省大庆市肇州县某猪场爆发传染病，急性败血为特征。无菌采集新病死猪的肺脏、肝脏、脾脏、肠段等病料。 1.1 .2 试剂按常规方法制备血液营养琼脂培养基、普通营养琼脂、 （BHI ）购自 BD 公司。革兰氏染色剂（结晶紫染液，革兰氏碘溶液，9
9、5%乙醇溶液，稀释石碳酸复红） ，0.85%生理盐水，抗生素类药敏片，脱脂乳，犊牛血清。生化管及药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司，批号为：200910161.1.3 主要仪器TG16 离心机 （长沙英泰仪器有限公司） 、显微镜（上海宙山光学仪器厂） 、超净工作台（江阴市爱特净化科技有限公司） 、DRP-9272 型恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司） 、摇床（郑州金泰公司） 。黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 2 -1.1.4 实验动物6 只昆明系小白鼠，体重 20 g23 g，为清洁级， 购自哈药集团黑龙江省生物制品一厂。1.2 试验方法1.2.1 流行病学调查及病理学观察 对黑
10、龙江省大庆市肇源县某猪场急性死亡病例进行系统的流行病学调查；临床症状以及病理学观察，以便于进一步了解其发病特征。1.2.2 细菌分离培养将无菌采集的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结分别接种于绵羊血液营养琼脂培养基，分别进行需氧培养和厌氧培养，37 培养 36h，然后挑取单个菌落进行纯培养，革兰氏染色镜检，观察菌落形态特征，菌体形态特征。1.2.3 生化试验按照常规方法对从不同猪内脏中分离的2株细菌进行生化试验。将上述培养的菌液在无菌台中在无菌操作的情况下，用接种环分别接入不同的生化管中，进行有氧或兼性厌氧培养，37 需氧培养36h 后观察结果。1.2.4 分离株药物敏感性试验把从该猪场分离到的菌株进行
11、药敏试验，选用青霉素、土霉素、庆大霉素、林可霉素、恩诺沙星和氨苄青霉素等 10 种临床常用药物，应用纸片法进行药敏试验，在每个含有 10%绵羊血液营养琼脂培养基（75mm）接种 5 个药敏纸片，37需氧培养 24 h 后，观察结果12.5 动物感染实验将分离到的 2 株细菌接种到 BHI 培养基中，37恒温空气浴震荡培养 18h。取0.1mL 应用平板计数法进行细菌计数可知含菌量约 1.56109 个/ml 9。 。计数后接种到体重约 18g 的昆明系小白鼠腹腔，每只小白鼠注射约 3108CFU，每株菌液接种 3 只，同时设立对照组 3 只，接种 0.2mL 无菌的 BHI 培养基，连续观察小
12、鼠的发病情况。2 试验结果2.1 流行病学调查结果黑龙江省大庆市肇源县某养猪场于 2010 年 11 月 7 日突然爆发以猪急性死亡为特征的病例，经问诊得知，此养殖户共有 110 只头，截止到 2010 年 11 月 10 日黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 3 -送检为止，以死亡 24 头猪 2010 年 11 月 8 日死亡 6 头 ， 2010 年 11 月 9 日死亡10 头，2010 年 11 月 10 日死亡 8 头，3 天内死亡 24 头，病死率为 21.8%。还有 9头猪已经出现临床症状，发病率为 30%，发病猪群并未注射任何疫苗；病猪的主要临床症状：病初，病猪体温 41以上
13、，精神沉郁，食欲减退，腹泻，皮肤潮红继而发绀。病猪卧地不起，很快死亡。治疗用过的药物有恩诺沙星、氟苯尼考、安痛定和地塞米松等均无效。2.2 病理变化结果皮下出血下颌淋巴结肿大，切面湿润多汁;喉头冲出血，腹腔积液，有纤维素性渗出；肝充血肿大、暗红色，脾充血、肿大，肾有出血点、坏死灶；心包胶胨样渗出，心肌出血;肺瘀血水肿，胃底黏膜弥漫性出血，胃底增厚，肠粘膜出血并有溃疡。2.3 细菌分离培养结果在 10%新鲜绵羊血液营养琼脂培养基和普通琼脂培养基上，需氧和厌氧条件下培养 24h 后均可见细菌生长。其菌落特征：在血液营养琼脂培养基上，血液琼脂平板上长出纤细、针尖大露珠样、透明、表面光滑、边缘整齐小菌
14、落，直径小于 1 mm ；该菌株在普通营养琼脂培养基能够生长。在 BHI 培养基中生长良好。在麦康凯培养基上不生长。镜检观察为革兰氏染色阳性，纤维平直或稍弯曲的细杆菌，多成不分支的长丝状。无荚膜和无芽孢。2.4 生化鉴定结果 分离的细菌能够发酵葡萄糖、乳糖、果糖产酸不产气;不发酵甘露醇、山梨醇、肌醇、鼠李糖、蔗糖、蕈糖、菊糖。产生硫化氢、不分解尿素。接触酶试验阴性，甲基红及 V-P 试验阴性，结果与 E.rhusiopathiae 的主要生化特性相符 10。结果见表 1。 有 2 株菌基本符合（E.rhusiopathiae）杆菌的生化特性：表 1 分离菌株生化反应结果生化特性 结果 生化特性
15、 结果葡萄糖 鼠李糖 乳糖 蕈 糖 果糖 山梨醇 甘露醇 肌醇 蔗糖 菊糖 MR VP 硫化氢注：表示为发酵糖并产酸不产气；表示为发酵糖或阳性反应；黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 4 -表示为不发酵糖或阴性反应2.5 药敏试验结果采用药敏试验纸片法选用对 E.rhusiopathiae 敏感且常用的 10 种抗菌药物进行药敏试验，其结果见表 2：表 2 猪丹毒杆菌菌株药敏试验结果药品 恩诺沙星氨苄西林氯霉素四环素强力霉素庆大霉素青霉素 G多粘菌素B复方新诺明头孢噻吩抑菌环（毫米） 12 18 10 12 10 0 22 0 0 22注：抑菌环直径2030mm 高度敏感；1020mm 中度敏
16、感；10mm 以下低度敏感；分离菌株对青霉素、氨苄西林、 、头孢噻吩素等药物高度敏感，对恩诺沙星、强力霉素、四环素、氯霉素等药物中度敏感，对庆大、多粘菌素B和复方新诺明等药物具有耐药性。2.6 分离株动物实验结果接种的小白鼠在 48h 内全部死亡，从死亡小白鼠心脏血液内仅分离到接种的细菌，剖检可见肝脏、脾脏和肺脏有出血点。对照组连续观察 1 周未见异常。采取病死小白鼠心血做回归试验，培养后得到 E.rhusiopathiae，确定此次疾病病原菌为 E.rhusiopathiae。3 小结与讨论在本研究中，2010 年 11 月 10 日，该猪场发生的以败血高热为特征的传染病，经病原学诊断后在病
17、死猪内脏器官内分离到了一种革兰氏阳性杆菌，经生物学特性鉴定和生化试验鉴定后确定分离菌株是 E.rhusiopathiae，最终确诊E.rhusiopathiae 是引起本次传染病暴发的主要病原。治疗：首选药物为青霉素，对急性型最好首先按每千克体重 1 万单位青霉素静脉注射，同时肌注常规剂量的青霉素，即 20 千克以下的猪用 2040 万单位，2050 千克的猪用 40100 万单位，50 千克以上的猪酌情增加。每天肌注 2 次，直至体温和食欲恢复正常。不宜停药过早，以防复发或转为慢性。预防:平时要加强饲养管理，猪舍用具保持清洁，定期用消毒药消毒。同时按免疫程序注射猪丹毒菌苗。与病猪同群的未发病
18、猪，用青霉素进行药物预防，等疫情扑灭和停药后，进行一次大消毒，并注射菌苗，巩固防疫效果。对慢性病猪及早淘汰，以减少经济损失，防止带菌传播。经过上述治疗，疾病很快得到了控制，死亡数逐渐减少。急性型猪丹毒一般不易于其他败血性传染病相区别，如败血性防线菌柄，最急性猪瘟，最急性猪肺疫，猪败血性链球菌，急性主副伤寒等应注意与他们互相黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 5 -区别。在临床上如果注意区别诊断 11。在本试验中，尸体剖检可见肺脏淤血水肿，肝脏淤血，脾肿大，肠粘膜出血和溃疡，眼观上很难与其他高热病原相区别，因此在临床诊断时应该注意鉴别这几种传染病以免误诊。必要时有条件的应结合实验室的病原学诊断。
19、本实验证明青霉素对猪丹毒杆菌有效，但在实际治疗中，很多养殖户往往陷入一个误区，猪场一旦发病，选用价格贵的一定比便宜的抗生素效果好，部分兽医也因药物利润等发面问题不会主动向农户推荐廉价抗生素，使青霉素等廉价抗生素在实际应用中往往不够及时。因前期不能有效治疗使病情进一步恶化，所以选用药物最有效的方法是先做好药敏试验，选用敏感而廉价药物进行有效治疗对发病猪场进行流行病学调查发现，该猪场对所饲养的猪并未做过免疫，没有打过任何疫苗，平时没有对猪场定期消毒，虽然坚持自繁自养，但没有做到全进全出。由此推断本次疾病的爆发主要与饲养管理不善有关。猪丹毒传播途径多种多样，应采取相应的综合措施，如消毒，杀虫，灭鼠，
20、搞好正常清洁卫生，建立严格的门卫制度，限制外来人员出入猪场等。本研究成功地从病猪脏器内分离到猪丹毒杆菌，为进一步研究猪丹毒杆菌病，建立快速的诊断方法和疾病防控措施奠定坚实的基础，猪丹毒引起的高热败血性疾病应该引起人们的重视。黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 6 -参考文献1 Wood R L.Erysipelas in Diseases of swine M. 8th.Ames: Iowa State University Press, 1999.419430.2WoodRL. Swineerysipelasarev黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 - 7 -iewofprevalenceandresearchJ.JAmV
