1、燕京理工学院 2015 届微生物学大作业1前 言乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是威胁着人民健康的全球性问题。目前,全世界受 HBV 感染者接近 20 亿,其中有超过 3 亿的慢性感染者。在亚太地区,慢性 HBV感染率超过 10%,其中 25%40%患者会因合并或不合并肝细胞癌的肝硬化而死亡。世界卫生组织已将 HBV 感染列为全球十大死亡原因之一。乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）引起的。HBV 的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌(hepat
2、ocellular carcinoma, HCC)的发生、发展密切相关。20的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV 慢性感染的人罹患 HCC 的危险性是正常人的 100 倍。HBV 感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）携带率在 2以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg 携带率 10左右） 。全世界共有约 3.5 亿人为 HBsAg 慢性携带者，其中 3/4 在亚洲。HBV 感染导致全球每年 50120 万人死亡，其中死于 HCC 的
3、约占 32 万。我国是 HBV 感染的高发区，约 60的人群感染过 HBV，10的人群为携带者，多达 1.2 亿。现有乙型肝炎患者约为 1200 万，年发病率为 158/10 万。随着 HBV 疫苗在 1982 年的问世，HBV 感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。燕京理工学院 2015 届微生物学大作业2第 1 章 课题研究背景与价值第 11 节 选题的意义与价值世界卫生组织估计全世界大约有 20 亿乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus,HBV）感染者，其中 3.54 亿为 HBV 慢性感染者，每年由于急慢性HBV 感染而死亡的人数达到 100
4、万，并呈上升趋势。乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险。而我国是乙肝大国，占据其中的 1/3，有 1.2 亿 HBV 携带者。从数据而知，乙肝病毒感染已成为危害人类健康的重要疾病，因此对 HBV 感染者有效的抗HBV 治疗在全世界特别是在我国显得尤为迫切。不幸的是，到目前为止，还没有针对 HBV 的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后 50 年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是重大的研究课题。1.1.1 理论意义与价值（1）就哲学的高度而言，乙型肝炎的现状不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大。HBV 对他们的生活产生了
5、极大的影响，携带者或患者的饮食起居，婚姻，学业全都受到很大影响。为了全世界人民免受其影响，乙肝病毒的防治研究刻不容缓。（2）就专业或学科角度而言，全世界大约有 20 亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染者，其中 3.54 亿为 HBV 慢性感染者，每年由于急慢性 HBV 感染而死亡的人数达到 100 万，并呈上升趋势。患者及携带者都面临发展为肝硬化和肝癌的危险。（3）就我国 HBV 的现状角度而言，我国是乙肝大国，占据其中的 1/3，有 1.2 亿 HBV 携带者。从数据而知，乙肝病毒感染已成为危害人类健康的重要疾病，因此对 HBV 感染者有效的抗 HBV 治疗在全
6、世界特别是在我国显得尤为迫切。1.1.2 实践意义与价值通过对 HBV 的传播途径和发病机理的研究，对乙肝病毒患者或携带者早发现早治疗，抑制病毒复制，促进病毒清除。减轻肝脏炎症及坏死，促进肝细胞燕京理工学院 2015 届微生物学大作业3修复。阻止或延缓发展为肝硬化。减少 HBV 相关性肝癌的发生率，改善患者的生活质量，延长生存期，缓解、减轻临床症状。避免病情发展成重症肝炎或慢性肝炎。第 1.2 节 研究目的与研究方法HBV 是嗜肝 DNA 病毒科的原型病毒，在宿主细胞核内形成共价闭合环状DNA(cccDNA)进行复制。药物治疗慢性乙型肝炎多采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和抗肝纤维化等方法，而
7、抗病毒治疗是其中最主要和关键的治疗措施。已发现的抗 HBV 药物种类十分有限，而且 HBV 倾向于不断的突变从而能够逃避特异性的抗 HBV 化合物的抑制作用，因此寻找有效的抗 HBV 药物的研究任重道远。燕京理工学院 2015 届微生物学大作业4第 2 章 HBV 的基本知识2.1 节 HBV 的概述乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）,是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，也称丹氏颗粒，简称HBV。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性。是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一 1P322-331，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性肝炎(Chronic Hepa
8、titis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”2.2节 HBV的生物学特性2.2.1 HBV 的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为一个新的病毒科嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成员。该科病毒成员除了人HBV外还有：（1）东方土拨鼠肝炎病毒（GHV） ，1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV） ，是1980年在美国南加州的地
9、松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV） ，1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒。 2.2.2 HBV的形态与结构 HBV 在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒，电镜下观察 HBV 的提纯制品，证明有三种类型颗粒 2P489-494。 (1)小球型颗粒 平均直径为 22nm，由空心病毒包膜组成，是 HBV 多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。 (2)管型颗粒 由小球型颗粒连接而成，其长短不一。小球型颗粒
10、和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。小球型颗粒和管型颗粒与 Dane 颗粒的燕京理工学院 2015 届微生物学大作业5比例依不同的病程差异较大，一般撒 Dane 颗粒的 10 4 108 倍，在患者血液中的含量可高达 10 13个/ml. (3)Dane颗粒 为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm，由包膜和核衣壳组成 3P121-150。核衣壳直径为27nm，含有HBcAg，单一分子的部分双链DNA以及依赖DNA的DNA聚合酶。核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护性容器。另一独特的特征是P蛋白与长DNA链共价结合。在患者血液中的Dane颗粒含量为10 4 10 6个/ml
11、. 图 2.1 电子显微镜下可以观察到乙肝病毒 3 种不同的形态： 大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒图2.2 肝病毒（HBV）结构示意图（立体图）燕京理工学院 2015 届微生物学大作业6图2.3 肝病毒（HBV）结构示意图（平面图）2.2.3 理化特性及抵抗力在氧化铯平衡梯度离心中，HBV 颗粒（42nm）的浮力为 1.22g/cm3.表面抗原颗粒为 1.22g/cm3，病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的30%。 HBV 对理化因素有较强的抵抗力。病毒在 30 32 可存活至少 6 个月，在 -20 可存活 15 年。病毒浓度高时，60 加热 10h,或 98 加热 1min
12、,以及乙醚或 pH2。4 处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活 HBV 的常用方法和条件包括 121高压灭菌 20min, 160 干烤 1h，100直接煮沸 2min,以及0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。HBV 的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活 HBV 感染性的条件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留。 2.2.4 HBV 的基因组和蛋白组成HBV 基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负（-）链为全长基因，约含 3200 个核苷酸，而正（+）链是负链长度的 2080%，病毒颗粒内含有 DNA聚合酶 4P280-283。在所有已知
13、可感染人体而且具有独立复制能力的双链 DNA 病毒中，HBV 基因组是最小但又是最高效的。 它具有以下 4 个鲜明的特点： （1）不完全双链环状结构； （2）利用重叠的开放读码框（open reading frame ORF）编码多个蛋白质；燕京理工学院 2015 届微生物学大作业7（3）所有调控序列均位于蛋白质编码区内； 图2.4 HBV基因组基本结构HBV 含有 4 个 ORF，即 S 区（包括 preS1、preS2 及 S） 、C 区（包括 preC和 C） 、P 区和 X 区，ORF 之间互相重叠。HBV 有 4 种转录子，共用一个 PolyA 加尾信号，长度分别为 3.5kb、2.
14、4kb、2.1kb 和 0.7kb。4 种 mRNA 合成 7 种病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白） 、核壳蛋白（前 C 和 C 蛋白） 、X 蛋白和P 蛋白 5P157-169。 外膜蛋白由 S 基因区编码，包括 3 种外膜成分：主蛋白（small protein ,S protein, 即 HBsAg） 、中蛋白（middle protein ,M protein, 即preS2+HBsAg）和大蛋白（large protein ,L protein, 即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在 3 种成分中含量最高。主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA 翻译而来，而大蛋白则是 2
15、.4kbmRNA 的产物。HBV 的外膜蛋白构成病毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。大蛋白在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫应答。 核壳蛋白由 HBV 基因组的 C 区编码，存在两种形式：核心抗原（HBcAg）和e 抗原(HBeAg). HBcAg 分子量 21KD，是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程燕京理工学院 2015 届微生物学大作业8中负责对前基因组 RNA 包装，这是基因组复制的必备步骤。HBcAg 有较强的免疫原性，几乎所有的 HBV 感染者均产生针对
16、 HBcAg 的抗体。HBeAg 是分泌性蛋白，先由 preC+C 区编码带有信号肽的 24KD 的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白酶切割后形成 16KD 成熟分子进入病人的血液中，HBeAg 可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清楚。HBcAg 和 HBeAg 均是 3.5kbmRNA 的翻译产物。P 蛋白即聚合酶（polymerasa, Pol）由 P 基因区编码， 是一个含 816 个氨基酸的大蛋白，也是 3.5kbmRNA 的翻译产物 6P299-305。目前已经发现 P 蛋白具有 4 个功能性结构域，P 蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作
17、用。HBV 前基因组 RNA 反转录过程中的几个关键步骤，包括 RNA 的包装、DNA 合成所需的引物、以 RNA 和 DNA 为模板合成 DNA 以及将 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 消化等，均涉及 P 蛋白的功能。由于 P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。 X蛋白由X基因区编码，其转录子为0.7kbmRNA。X蛋白具有多种功能。它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶C，从而影响细胞信号转导。病毒在体内复制和传播也需要X蛋白的参与。 2.2.5 HBV 的复制在 HBV 的复制过程中，最突出的特点是，作为 DNA 病毒，HBV 不以 DNA 为
18、模板进行复制，而是将 DNA 转录 RNA 中间体（RNA intermediate）或称前基因组 RNA，再逆转录成 DNA 进行复制，与逆转录病毒的复制过程类似。HBV 的复制过程有以下几个环节： （1）侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体（至今不清楚）结合，脱去外壳 核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒 DNA 及聚合酶进入细胞核； （2）修复：HBV 聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,即超螺旋结构，是病毒复制的重要标志； （3）转录：宿主 RNA 聚合酶以 c
19、cc DNA 为模板，转录出长短不一的mRAN,这些 mRNA 分子从细胞核转移到细胞质； （4）复制： mRNA 分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X 和聚合酶等多种蛋白。3.5kbmRNA 被成为前基因组 RNA（pregenomic RNA,pRNA）,含有病毒编燕京理工学院 2015 届微生物学大作业9码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是 HBV 基因组复制时反转录的模板。在细胞质内，核心蛋白包裹 pRNA 和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以 pRNA 为模板，逆转录出负链DNA，pRNA 被降解：再以负链为模板，合成正链 DNA，形成部分
20、双链的环状DNA，即成熟的病毒基因组； （5）循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内一定量的 ccc DNA； （6）释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。 图2.5 HBV的复制过程燕京理工学院 2015 届微生物学大作业10第 3 章 HBV 的显微镜观察3.1 节 电子显微镜技术电子显微镜技术主要包括常规电镜法(electronmicros-copy,EM)和免疫电镜法(immune electron microscopy,IEM)。 （1）常规电镜法1970 年英国学者 Dane 等在电镜下发现了完整 HB
21、V 颗粒即 Danes 颗粒2,R De Vos 等随后用电子显微镜观察 18 例 HBsAg 阳性的慢性肝炎患者的肝组织,发现了直径约 25 nm 的核心抗原(HBcAg)颗粒 7P300-305。常规电镜法的优点是标本用量小、制样速度快、观察比较直观,不过因其观察灵敏度较低而要求病毒在标本中大量存在,所以本检测技术在观察 HBV 方面的应用受到限制。 （2）免疫电镜法免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。Takashi 等 8P141-148对 96 例HBsAg 阳性患者的肝组织进行免疫电镜观察,发现在肝细胞胞浆和胞核中
22、存在HBcAg 和 HBeAg。胡莲美等在 HBV 转基因小鼠血清中发现直径约 22nm 的球形HBsAg,以及少量直径约 42nm 的 Danes 颗粒。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,从而可增加 HBV 的检出率,但该检测技术的样本制备过程较复杂,对操作者的技能要求较高。3.2 节 HBV 的显微镜观察试验乙型肝炎病毒（HBV）是 1970 年由 Dane 氏发现，经电镜检查显示 HBV 有 3种基本形态，其中最多的是 22nm 的小球形及直径相同而长度超过 200nm 的长条丝状体，最少的是直径 42nm 的圆球体，即具有感染性的 Dane 颗粒。Dane 颗粒内有 1 个 27nm 直径的核心，含双链 DNA，外壳为无感染性的 HBsAg 蛋白质，其某些特性提示它可能是 HBV 的完整形式。Dane 颗粒的发现为研究 HBcAg 提供了基础。本实验将含有 Dane 颗粒的 HBsAg 阳性血浆，根据其沉降速度和浮密度的
