1、1第四章 高 效 液 相 色 谱 法 （HPLC）high performance Liquid chromatography一. 高效液相色谱法的特点：1、高压2、高效3、高速4、高灵敏度5、应用广泛HPLC 与 GC 共同点：1、色谱的基本理论是一致的2、定性定量原理完全一样HPLC 与 GC 区别：1、流动相不同2、固定相不一样3、仪器的结构差别较大二. 高效液相色谱仪的结构1. 高压输液系统 P.244(1) 贮液罐用于存放流动相，其位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差，应耐腐蚀，尽可能密闭，以防因溶剂易挥发而引起流动相组分的变化以及空气中的 O2、CO2 等重新溶于已脱气的流动相
2、中。(2)、高压输液泵 P.245其产生高压将流动相送入系统，所以对高压泵有如下要求：a. 泵体材料能耐化学腐蚀；b. 能在高压连续工作；c. 输出流量范围宽；d. 输出流量稳定，重复性高 (3) 梯度淋洗装置 P.2452. 进样系统 P. 246 它将待分析的样品注入系统进行分析。目前主要采用六通阀为核心的额进样器，其有“进样”和“取样 ”两个位置，当处于“取样”位置时，流动相不经过样品管，此时可打开进样口注入样品到样 品管，封上进样口，然后切换到进样的位置，流动相就经过样品管冲洗样品到色谱柱完成进样的动作。如果是自动进样器，则这一切将按程序自动完成取样、进样、复位、样品管路清洗等过程。3
3、. 分离系统（色谱柱） P.246色谱仪中的分离核心，样品在此完成分离，故其性能对分析结果起关键作用，其主要参数有填料的类型、柱子长度、内径的大小等。24. 检测系统 P.247主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由数据处理系统绘出图谱来进行定性和定量分析。理想的液相色谱监测器应具备如下特征：灵敏度高；对所有的溶质都有响应；响应对流动相流量和温度的变化都不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用范围广。常用的检测器有紫外检测器（UVD） 、示差折光检测器（RID） 、电导检测器（ECD） 、荧光检测器（FD）和蒸发激光散射检测器（ELSD 等。 5. 数据处理系统色谱分析结果,以前
4、主要采用记录仪和积分仪来处理.现在几乎都使用 PC 机结合色谱工作站来处理数据，大大提高了工作效率和结果的准确性。3. HPLC 分析常用的几种色谱分离模式的原理和应用 P.2501.固定相 流动相2.高效液相色谱通常依据溶质（样品）在固定相和流动相分离过程的物理化学原理来分类，主要有以下几种色谱分离模式：1)、吸附色谱 2)、分配色谱 3)、离子色谱 4)、体积排阻色谱 （凝胶色谱 ）5)、亲合色谱法 6)、手性色谱法 2). 分配色谱(1)正相色谱：流动相极性小，固定相极性大(2)反相色谱：流动相极性大，固定相极性小各种色谱法的比较方法项目吸附色谱 分配色谱 离子色谱 排阻色谱 亲合色谱固
5、定相 全多孔固体吸附剂键合在基体上的键合相基团高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔凝胶键联在基体上的特异配位体流动相 不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同 PH 的缓冲溶液有机溶剂或一定 PH 缓冲液可加改性剂的PH 缓冲液分离原理 吸附 解吸 溶解 挥发 可逆性离子交换多孔性凝胶的渗透或过滤钥匙结构络合物可逆性离解平衡常数 吸附系数 KA 分配系数 KP 选择性系数 KS 分布系数 KD 稳定常数 KC主要应用 中等分子量的脂溶性化合物大多数的化合物的分离与分析离子型化合物的分离与分析大分子的化合物的分离和分子量测定生物活性物质的分离与分析3CH3COCH3溶 剂样 品 的 官 能 团极
6、 性 非 极 性水 甲 醇 异 丙 醇 乙 腈 THF乙 酸 乙 酯 CH2lCHl3己 烷NH3X/ArOHRCOH CNH2RO RCN 醛 /酮 N(R)2 NO2 卤 代 烷 烃 烷 烃四. 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤准备工作想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如 CA(化学文摘) 仪器制造商的文献对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 要分离（即制备）的样品量有
7、多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?1.选择一种适当的色谱分离模式，见下图。2.选择一根合适的色谱柱，包括规格和填料类型43.选择适当的色谱分离条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法，进行分离条件的优化，实现下面的结果： 在保证一定分离度的条件下达到最快的分析速度。 在保证分析时间的条件下对难分离物质获得最大的分离度。请记住：每次改变一个参数4.对获得的色谱图进行定性和定量分析。样品的预处理重要性占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其
8、他化学品实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤样品预处理常用的方法高速离心 过滤、超滤 去除微粒 过滤膜/过滤装置高速离心 大于：10,000g选择性沉淀样品衍生反应固相萃取（SPE）技术液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak 样品处理小柱浓缩样品确认回收率色谱分离模式的选择5样 品分 子 量 小于 20 分 子 量 大于 20溶于水 溶于有机溶剂非离子化 非离子化RPICGFRP 溶于己烷等溶于甲醇等 NPACRPGC溶于水 溶于有机溶剂RPICGFGPCAC： 吸 附 色 谱 ， NP： 正 相 色 谱 ， RP： 反 相 色 谱 ， IP： 离
9、子 对 色 谱 ，I： 离 子 色 谱 ， GP： 凝 胶 渗 透 色 谱 GF： 凝 胶 过 滤 色 谱样 品分 子 量 小于 分 子 量 大于溶于水 溶于有机溶剂非离子化 非离子化 溶于己烷等溶于甲醇等 溶于水 溶于有机溶剂样 品分 子 量 小于 分 子 量 大于溶于水 溶于有机溶剂非离子化 非离子化 溶于己烷等溶于甲醇等 溶于水 溶于有机溶剂： 吸 附 色 谱 ， ： 正 相 色 谱 ， ： 反 相 色 谱 ， ： 离 子 对 色 谱 ，： 离 子 色 谱 ， ： 凝 胶 渗 透 色 谱 ： 凝 胶 过 滤 色 谱五. HPLC 分析常用小器具和基本使用方法 1、溶剂过滤器对流动相进行过
10、滤的装置，同时也完成了脱气，主要由过滤瓶、真空泵和至少0.45um 孔径的微孔滤膜组成。微孔滤膜有水系、有机系和两用膜三种，两用膜价格比较昂贵一些。使用时装上相应的滤膜，连上真空泵，从上面倒入待过滤流动相，启动真空泵直至过滤完所需的流动相。2、脱气装置除用溶剂过滤器脱气外，还可用超声波法和氦驱赶法对已过滤过的流动相进行脱气处理，操作都很简单。 3、样品过滤器由于样品的量较少，一般就用针头过滤器和小体积的注射器来过滤样品，针头过滤器有直径为 13mm 和 25mm 两种规格。 4、固相萃取小柱（SPE）主要在样品预处理时用来去掉干扰的杂质以及对目标化合物的富集，随着填料的发展，这种样品预处理技术
11、应用越来越广，应用效果越来越理想。在使用时，首先详细阅读产品说明书，了解产品特性，结合自己的样品的相关性质进行条件试验，找出最优化的方法。 5、预柱（保护柱）使用预柱可以达到在线富集、净化样品和保护色谱柱的作用，但同时也会引起谱带6的扩宽，为尽可能降低扩宽程度，应该使用与分析柱完全相同的填料填充预柱。 6、在线过滤器用来防止色谱柱堵塞而加在色谱柱前的一个过滤装置，主要结构就是一片孔径为0.45um 的不锈钢烧结过滤片，只起过滤作用，故应定期清洗。六.HPLC 基本故障的分析和处理方法 1、每次使用时，开机后首先看看有没有漏液的情况，在所有的连接头部分都有可能，如果是泵头漏液，就必须更换里面的密
12、封圈，如果是普通的接头处漏，紧一紧接头即可，如仍不行就更换接头。2、其次，看看压力是否正常。如果压力一直升高，说明系统有堵塞，这时最好先检查色谱柱，方法是拆去色谱柱，开机看压力情况，如正常，则说明色谱柱堵塞，更换或清洗色谱柱；如仍升高，则可能管路堵塞，应从泵后开始按顺序一段一段的检查，清除相关问题。如果压力升不上去或波动太大先看有无泄露情况，再看系统中有没有气泡，如有请先排气泡；然后再检查泵头上的进口单向阀和出口单向阀是否堵塞，如有堵塞请清洗或更换；最后再查泵的密封圈是否损坏，如坏则更换。3、然后，用流动相平衡色谱柱，检测器预热足够长时间后，看基线是否平稳，噪音是否太大。基线不稳一般由下列因素
13、引起：流动相流量波动；流动相组成发生变化；检测器灯的能量不稳；色谱柱尚未平衡好、色谱柱损坏或柱效下降等环境温度变化太大；电源不稳定，最好采用高性能的电源稳压器。 4、 最后，进样分析.考察分析结果，看结果的重现性如何，峰形如何。保留时间的重现性一般与流动相的稳定性、色谱柱的性能等有关，而峰面积或峰高的重现性除了前两者外，还与进样技术、检测器性能等有关。峰形的好坏则主要与系统的死体积、色谱柱的性能、色谱条件的选择等有关。 七. HPLC 仪器的日常维护仪器的日常维护非常重要，其可避免故障的高发生率，提高仪器的使用率和工作效率。以下对高效液相色谱系统的各个部件的常规维护作一简单的提示，具体的做法最
14、好详细参考仪器说明书。 1、贮液器(清洁.滤膜.定期清洗）清洁是保持流动相贮液器正常使用的关键，要尽可能的使用 HPLC 级的溶剂和试剂。含有缓冲盐和非 HPLC 级的流动相一定要经过 0.5um 的过滤膜过滤以除去其中的微粒物质。改变流动相是应防止交叉污染，陈旧的流动相和用久了的试剂应定期废弃或用适当的方法保存，避免微生物生长和组分的改变。贮液器内壁要定期清洗。等等。 72、泵（密封垫圈.盐沉积. HPLC 级试剂）泵的密封垫圈是最易磨损的部件，其损坏可引起许多系统故障，一旦损坏只能更换，故应采取以下措施来延长垫圈的寿命：每天要把泵中的缓冲盐洗干净，防止盐沉积，泵要浸在无缓冲盐的溶液或有机溶
15、液中；尽量用 HPLC 级试剂；溶液管前用烧结不锈钢沉子以过滤微粒物质。另外，要防止因系统堵塞而导致的高压使柱塞杠折断或烧毁电机。 3、进样器停机后要冲洗干净进样器内残留的样品或缓冲盐，防止盐沉积和样品微粒造成阀转子面磨损或堵塞，对于手动进样器应避免尖针头进样，防止密封垫损坏。4、色谱柱主要是防止色谱柱性能的下降，应做到： 溶剂的化学腐蚀性不能太强； 避免微粒在柱头沉积； 系统的压力不能太大； 流动相的 PH 值应在色谱柱正常使用的 PH 范围内； 最好在柱前使用在线过滤器或加保护柱； 使用合理的方法清洗色谱柱； 根据色谱柱所附的说明书的要求正确保存长 期不用的柱子。色谱柱保护 使用保护柱 仪
16、器在使用完毕，要冲洗整个系统移走系统中缓冲液 过滤所有的溶剂和样品 柱子在不使用时，两端密封保存 在适当的溶剂中保存柱子 注意色谱柱的 pH 值使用范围 不要高压冲洗柱子 不要高温下过长时间使用硅胶键合相5、检测器要保持检测器的清洁，每天用后连同柱子一起冲洗。提倡不定期用强溶剂反向冲洗检测池（先拆开柱子，再反接） 。防止气泡卡在池内。注意有效利用检测器的灯源，不用时不要开灯（预热时除外） 。 8. HPLC 定性分析和定量分析的方法 （与 GC 的方法相同）定量分析误差定量分析误差主要由下面各过程中的失误引起： 样品的准备：取样不具代表性；配制样品的溶剂不合适；储藏样品不当及预处理不合理等。
17、进样技术：进样器的结构，操作人员进样技术的熟练程度，进样量的大小等都对色谱8分析的结果有影响。 色谱柱的稳定性：物理强度好、色谱性能稳定的固定相可以减小误差。 流动相的稳定性：流速稳定、流动相的组成稳定有利于减小误差。 检测器的特性：灵敏度、噪音、线性特性、响应信号波动都会导致误差。 分离度：其主要影响峰高和峰面积测量的准确度从而导致误差。 峰高法和峰面积法的选择：定量方法的选择既能影响准确度，又能影响精确度，下表对两种方法的选择进行总结。色谱分析时遇到的问题 定量方法的选择流量波动 峰高流动相组成变化 峰面积温度波动 峰面积色谱柱超负荷 峰面积分离度小 峰高峰严重拖尾 峰面积检测器时间常数太
18、大 峰面积色谱柱柱效下降 峰面积九.摸索 HPLC 测定新方法的一般程序（. 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤）准备工作想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如 CA(化学文摘) 仪器制造商的文献对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品 1、资料的收集 2、所需实验用具的准备 3、色谱条件的摸索（对标准品） 。 4. 样品预处理方法的摸索 5、色谱条件的进一步摸索（对样品） 6、方法学鉴定。 7、方法验证十. 样品预处理物理法：1、过滤法 2、稀释法 3、浓缩法 4、离心法 5、粉碎法 6、膜分离法 化学法：1.萃取法
19、2、蒸馏法 3、衍生法 4.皂化法 5.水解法 6.沉淀法等9例如：应用高效液相色谱法分析维生素之一维生素 色谱法与分离柱 分离条件 备注维生素 A 反相色谱、ODS-18 柱 流动相：甲醇水，982。流速：1ml/min。荧光检测器：EX：325nm,EM:470nm，或紫外检测器：325nm。测定视黄醇维生素 A 正相色谱、Si-60 柱 流动相：正已烷与正丁醇 982。流速： 2ml/min。荧光检测器：EX：325nm，EM：475nm。测定全-反式- 和13-顺式-视黄醇 -胡萝卜 反相色谱、ODS-18 柱 流动相：乙腈、甲醇和二氯甲烷。75/20/5。流速：1.5ml/min。紫
20、外检测器：450nm。测定全-胡萝卜维生素 D 正相色谱、Si-60 柱 流动相：正已烷异丙醇 991。流速： 1.5ml/min。紫外检测器：265nm。测定总维生素 D维生素 D 反相色谱、ODS-18 柱 流动相：甲醇水，982，流速： 1ml/min。紫外检测器：265nm。进样量：20ul/次可测定维生素D2 和 D3维生素 D 正相色谱与反相色谱结合使用流动相：正已烷异丙醇 991（正相） ，甲醇水，982（反相） ，进样量：200ul/次（正相） ，20ul/次（反相） ，紫外检测器：265nm。可排除样品杂质干扰，准确定量维生素 K 反相色谱、ODS-18 柱 流动相：乙腈甲醇
21、水、70228，流速：2ml/min。紫外检测器：270nm。进样量：25ul/次测定维生素 K15色谱条件色谱条件 1：1色谱柱：普通 ODSC18 柱（4.6250mm，dp 5um）;2流动相：乙腈：四氢呋喃75:253流速：1ml/min4检测波长：453nm色谱条件 2：1色谱柱：Waters 胡萝卜专用柱（4.6250mm，dp 5um）2流动相：叔丁基甲醚：甲醇：水49:50:43流速：1ml/min4检测波长：453nm色谱学作业1. 色谱法定性和定量的依据是什么？ 2. 什么叫程序升温？它有什么作用？3. 什么叫梯度洗脱？它有什么优点？4为什么用分离度 R 作为色谱柱的总分离
22、效能指标？5. 根据速率理论，色谱柱的板高 H 由哪些因素决定？试给出最佳流动相流速 U 最佳和最10小板高 H 最小的计算公式。6. 以固定相和流动相的极性及组分出峰顺序说明什么是正相色谱和反相色谱。7. 试比较高效液相色谱法与气相色谱法这两种分析法之间的异同，并做简要说明。8. 在一根 3m 长的色谱柱上分离一样品，空气出峰的时间为 1min，组分 1 和组分 2 的保留时间分别为 14 和 17min，其中组分 2 峰底宽度为 1min。试计算： (1) 该色谱柱分离组分 2的理论塔板数；(2)若完全达到分离，所需的最短柱长为几米？1. 高效液相色谱仪一般分为几个部分？从仪器构造、分离原
23、理、应用范围等方面比较气相色谱与液相色谱的异同点。2. 在液相色谱中，提高柱效的途径有哪些？其中最有效的途径是什么？氨基酸自动分析仪（专一的 HPLC 离子交换色谱）在农业上应用很广1。氨基酸- 含有氨基和羧基的有机化合物蛋白质由 20 种氨基酸以不同长短和不同排列组合而成，因此自然界蛋白质的种类是个天文数字。组成蛋白质的氨基酸有 20 种自然界 AA 有上百种（衍生 AA，牛黄酸等）八种体内不能合成的，必须由食物供给的必须 AA-赖 AA，色 AA，异亮 AA，亮AA，苯丙 AA，蛋 AA，苏 AA，颉 AA。赖 AA 是动物营养中的第一限制 AA（如缺其，其它 AA 再多也是浪费。 ）游离
24、状态氨基酸-生理体液：血液，尿液，植物细胞液等。2等电点：-蛋白质分子内阴，阳电荷相等时的 PH 值两性离子的正，负电荷相等呈中性，偶极离子酸性氨基酸：-COOH 羧基 -NH +2 氨基碱性氨基酸：-COO- NH2+3构成蛋白质氨基酸的等电点，从 2-10 范围，决定于其结构，氨基酸是两性物质，在不同 PH 值，处于不同物质状态氨基酸经典定量分析法：茚三酮 + 氨基酸-亚氨酸11（柱 后衍生） （天蓝色复合物）颜色深浅与氨基酸含量成正比570 NM440 NM （脯氨酸，羟脯氨酸）可见光检测器 (紫外， 荧光 检 测器 ）4分析原理： HPLC 离子交换色谱流动相：PH 值不同的缓冲溶液柱
25、子：带磺基（SO3）的阳离子（Na+）交换树酯分析过程：用 PH=2.2 HCL 溶解样品，比所有 AA 的等电点都要低有利于（-NH2）电离，不利于（-COOH）电离所有 AA 呈酸性解离：RCHNH3 +COOH 状态进入柱子有利于NH+3 和SO3-结合12梯度洗提：PH 盐浓度 洗脱能力1 号缓冲溶液 3.3 小 弱2 号缓冲溶液 3.3 小 较强3 号缓冲溶液 4.3 大 强4 号缓冲溶液 4.9 大 最强再生液：（NaOH 溶液）方法：A.柱后衍生（经典）茚三酮 ，缓冲溶液 6070 分钟B.柱前衍生HPLC 反相柱 已晴等 3040 分钟5.AA 分析的样品处理（蛋白质水解氨基酸
26、）（1）准备：代表性，均匀，粉碎，测水分，粗蛋白。糖份，脂肪（先除去） ，可用石油醚，已醚。（2）水解（关键）蛋白质-瞟-多肽-肽-氨基酸（1）酸解A. HCL B. RSO3HA.优点：水解彻底，水解后，要除去 HCL 很容易；不会发生消旋作用，都水解成 L型AA。（SD ，自然界， L型 AA。 ）D-型 AA缺点：色 AA，被破坏（2）碱解NaOH优点：色 AA 不被破坏缺点：发生消旋作用；丝，苏，精，胱 AA，遭到不同程度破坏（3）酶解优点：专一性很强，很彻底。但是：价格高，酶本身也是蛋白质，自溶，测定误差。酶：蛋白质 1：5013影响水解的因素：1.样品性质（脂肪，糖份等）2.试剂选择3.水解液用量（6NHCL，3035ML）4.封管技术5.真空（温度高，易氧化）（胱 AA，丝 AA 等有不同程度氧化，可加球基已酸，得到一定保护）6.时间（2024 小时，温度：105110）游离氨基酸：（医药，植物等领域）为了获得游离 AA，必须先除去蛋白质（柱子不可逆转的损坏）1.化学方法磺基水杨酸（使蛋白质变性，分子很大，沉淀，过滤膜，或高速离心 10000 转/分2.沸腾法例如鸡蛋，变性，凝固。 （氨基酸易转化，较少用）作业:从离子交换色谱原理试述氨基酸自动分析法中各类氨基酸的洗脱顺序。
