1、性病的实验室诊断,1. 有实验室负责人，实验人员分工明确 2. 实验室人员应该定期参加培训、进修或专业研讨会 3. 有实验室各项管理制度 4. 制定常规实验室标准操作程序（SOP）,性病实验室的组织管理,性病实验室质量管理,1仪器、设备实验室所有使用仪器应有使用、保养及维修记录有温控的仪器需每天记录温度 2培养基及试剂 严格按配方及技术要求配制培养基及试剂 对配制的培养基及试剂应有质检 购买的试剂盒应为经国家有关部门检验合格的产品（附有关证明） 所有培养基及试剂的保存都应符合要求,性病实验室质量管理,3质控 （1）实验室开展室内质控，包括使用阳性 对照和阴性对照质控品 （2）定期进行室间质控和
2、参加外部质控,4,性病实验室诊断技术,性病是一组传染病，主要通过性的接触传染。 包括细菌、真菌、病毒、衣原体、支原体、螺 旋体、原虫和寄生虫等性病实验室诊断有着及其重要的作用正确诊断提供科学依据,5,病原体 淋球菌 梅毒螺旋体 生殖器疱疹病毒 生殖道沙眼衣原体 乳头瘤病毒 HIV病毒 杜克雷噬血杆菌 衣原体 念珠菌 滴虫 疥虫 阴虱 肝炎病毒 ,病 种 淋病 梅毒: 生殖器疱疹: 生殖道沙眼衣原体感染: 尖锐湿疣: HIV感染/艾滋病: 软下疳: 性病性淋巴肉芽肿: 念珠菌性阴道炎: 滴虫性阴道病: 疥疮: 阴虱病: 肝炎（乙、丙）： ,性传播疾病(STD)/性传播感染(STI),主要常见性病
3、实验室检测介绍,梅毒 淋病 生殖道沙眼衣原体感染,常用梅毒检测方法,病原学检测血清学检测,病原学检查,原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。 方法：病原学检查的主要方法有暗视野显微镜检查、镀银染色法和直接荧光法,暗视野显微镜检查,标本采集部位： 一期或二期梅毒的皮肤或粘膜损害有痂者去痂，先用无菌棉球或纱布蘸生理盐水，将皮损拭净，轻压皮损至渗液（避免出血）。然后用载玻片印取渗液，立即检查，未破溃者用手术刀刮破皮疹，取渗出液。 淋巴
4、结穿刺液以无菌操作法用注射器吸取0.3-0.5ml生理盐水，穿刺入淋巴结，再回吸数次，最后将吸取液涂玻片上，立即检查。,暗视野显微镜检查,制片 标本置于载玻片上，加一滴生理盐水，盖上盖玻片，在暗室中于暗视野显微镜上油镜观察 观察 先用低倍镜，再转至高倍镜 梅毒螺旋体在暗背景上呈白色发光，螺旋整齐，运动规律（旋转、伸缩或蛇行运动）,梅毒螺旋体特征,螺旋整齐，数目固定 折光性强，较其他螺旋体亮 运动缓慢而有规律，有三种运动方式 围绕其长轴旋转运动 伸缩其螺旋间距离移动 弯曲扭动如蛇行,病原学检查的临床意义,病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。 螺旋体检
5、查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。 如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性,暗视野显微镜检查,结果解释阴性结果不能排除梅毒，可能是：螺旋体数量不足 已用过抗生素或某些外用药 损害接近自然消退,15,梅毒血清学检测方法,梅毒实验室操作要求,梅毒血清学试验操作和结果分析 标本的采集和分离编号或姓名登记采血、分离血清和贮存,16,梅毒实验室操作要求,试剂准备 温度、器具的校正试剂、血清和反应板恢复到试验温度试剂鉴定,17,梅毒实验室操作要求,试验操作 血清量的控制试剂量的控制旋转仪速度和时间的控制,18,非梅毒螺旋体抗原血清试
6、验,1、原理： 梅毒螺旋体感染人体后，宿主会产生抗类脂抗原的抗体，可检测梅毒患者血中的抗类脂抗原的抗体 2、方法：快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验 (VDRL),RPR,定性试验 在纸卡圆圈中加入50L待检血清，涂满整个圆圈 使用滴管和专用针头（60滴/mL），加1滴抗原悬液 旋转100rpm 8min 立即判断结果,RPR,定量试验 待检血清用等渗盐水在纸卡圆圈中作6个稀释度：原血清，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32 按定性试验步骤操作，以出现阳性反应的最高稀释度报告结果,RPR定量试验,中等至大的凝块为阳性（圈4和7）有
7、明确但很小的凝块为弱阳性（圈2和3）颗粒均匀分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）为阴性,非梅毒螺旋体抗原血清试验的优缺点： 优点： *敏感性特异性好*不需要昂贵设备，简单易行*适用于大量人群的血清筛查*有效治疗后血清滴度可下降并阴转，故可作疗效观察、判愈、复发。*20分钟可获得实验结果。*试剂与方法均已标化，各实验室间结果可比较。*试验可被内部质控和外部质控监控进行。 缺点：*敏感性和特异性低于螺旋体抗原试验，BFP反应和前带现象,非特异性血清试验的假阴性：1）有25%40%的未治梅毒在晚期隐性期可自然逆转为阴性，约30%的心血管和神经梅毒呈阴性。 2）前带现象（the prozonph
8、enomenon）, 即为抗原抗体量比例不适，抑制阳性反应。一般易发生在滴度在1：500以上的标本中。 1%的II期梅毒会出现前带现象。 3）操作人员应注意实验的温度，试剂盒从冰箱取出后应恢复至室温，室温过低（10）可能出现假阴性或结果不准确。,非特异性血清试验生物学假阳性0.25%0.86%阳性标本为生物学假阳性，主要出现在自身免疫疾病（所有BFP反应的14%）的患者、其它病原体感染（病毒性肺炎、恶性肿瘤和麻风）、妊娠妇女。应排除技术性、生理性和生物学假阳性，并用特异性试验来证实。,非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的
9、筛查。 早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。 经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。,梅毒螺旋体抗原血清试验,1、原理：用梅毒螺旋体特异蛋白为抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体 2、方法：梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒IgM抗体检测（IgM）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验,原理：用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原，
10、或重组抗原包被固相，检测特异性梅毒螺旋体抗体其敏感性和特异性有待进一步评价,快速试验-免疫渗滤法,在试纸条上包被螺旋体特异性抗原成份，如47kD、15kD抗原，利用免疫渗滤技术，将试纸条插入待测血清，观察血清与特定抗原成份的反应 可在10分钟之内得到结果，快速、方便 是特异性螺旋体实验 需要进一步验证方可用于临床诊断,梅毒螺旋体抗原血清试验,梅毒螺旋体颗粒凝集试验：用整菌和其片断做抗原致敏的明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集反应。敏感性和特异性接近最佳，分别为95%和99.9%。容许做梅毒的精确诊断。,30, 注意事项新溶解的“C”“D”应置30分钟以
11、上才能使用，已溶解的“C”“D”液用前需恢复至室温并充分摇匀。专用滴管应标明不能混用，不能用来稀释血清。未致敏孔不发生凝集，否则试验无效。如果标本与非致敏和致敏颗粒均产生凝集，需作重吸收试验。反应板要清洁干净，孔内无异物。试剂保存于210，不可冻结，不同批号试剂间不可混用。,梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如TRUST等)初筛阳性标本的确证试验。 梅毒患者经过抗梅治疗后，TPPA等梅毒螺旋体抗体试验仍可阳性，故TPPA等试验阳性不能作为疗效观察的指标。 TPPA等阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。,讨论,RPR检测抗心磷脂
12、IgM/IgG抗体 TPPA检测抗梅毒螺旋体IgM/IgG抗体 TP-IgM-ELISA试验检测抗梅毒螺旋体IgM抗体 IgM抗体最早产生并随疾病的治疗而逐渐下降或消失 IgM试验可用早期诊断,33,梅毒血清学试验结果的临床意义总汇,TRUST TPPA 意义RPR TP-ELISAVDRL TP-RT_ _ 排除梅毒 一期梅毒的早期 + + 现症梅毒(梅毒孕妇所生 的婴儿除外) + - 生物学假阳性- + 早期梅毒经治疗后,以临床诊断为目的的检测策略一,以临床诊断为目的的检测策略二,二、淋 病,淋病的实验室诊断,淋病在我国的发病人数是最多的性病 由淋病奈瑟氏菌引起的泌尿生殖道的化脓性感 染淋
13、菌性尿道炎、淋菌性宫颈炎等 实验室诊断本病主要为常规方法和分子生物学方法,常用淋病检测方法,直接显微镜检查 分离培养淋球菌,直接显微镜检查,原理：男性淋菌性尿道炎患者常有大量黄白色脓性分泌物，其多形核白细胞内可找到革兰染色阴性的双球菌。 方法：革兰染色为一传统方法，革兰染色将菌分为二大类，即染成紫色的革兰阳性菌及染成红色的革兰阴性菌。,直接显微镜检查的临床意义,男性淋菌性尿道炎的尿道标本敏感性及特异性可高达95%99%，具诊断价值。 宫颈标本、无症状男性尿拭子及取自直肠的涂片时敏感性仅4070%。 不推荐直接显微镜检查诊断直肠和咽部淋球菌感染。 亦不能用于疗后判愈。如果在多形核细胞外见到形态典
14、型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。,直接显微镜检查的临床意义,女性病人敏感性低，其影响因素较多。宫颈分泌物中杂菌较多，有的在形态上类似于淋球菌简便、有效、价格低廉,淋球菌的生物学特性,淋球菌为需氧生长菌 用普通培养基不易培养成功 营养要求高,需在含有动物蛋白的培养基中能生长好 生长时的营养要求不一 营养需要不同的原因在于不同的菌株其生物合成酶有缺陷,43,淋球菌的生物学特性,淋球菌喜潮怕干，干燥的条件下1小时就死亡 不完全干燥的条件下，附着衣服或被褥中生存1824h 室温则12天内死亡-30可保寸23个月 -70为6个月 ph：7.07.5,44,淋球菌培养,1原理：淋球菌在适宜的培养基上
15、可生长出特征性的菌落，根据菌落大小、形态、光泽、边缘、颜色等情况，可以作为淋球菌的鉴定依据之一。 2、方法特点： 敏感性 81100%。特异性 100%,淋球菌培养,培养条件 ： 35 36，含5%10% CO2，湿润（70%湿度）的环境。 CO2环境可由CO2培养箱、CO2产气袋及烛缸提供。使用烛缸时，应使用白色、无芳香味的无毒性蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。 培养时间：2448小时,淋球菌的初步鉴定,初步鉴定淋球菌的依据 菌落特征 氧化酶试验 革兰染色,3 细菌培养选择性培养基上培养典型 菌落氧化酶试验阳性镜检革 兰氏阴性双球菌。,淋球菌培养的临床意义,培养法为诊断淋病的金
16、标准. 用于女性感染者、亚临床感染者、以及来自直肠和咽部的感染的确诊试验。,生殖道沙眼衣原体感染,常用生殖道衣原体感染检测方法,抗原检测酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫层析快速检测 核酸检测,酶联免疫吸附试验,1、原理：与衣原体特异性单克隆抗体形成抗原抗体复合物，通过酶联显色反应检测衣原体抗原。 2、方法特点敏感性：7997特异性: 9799 试验结果阴性时，不能完全排除沙眼衣原体感染，有可能是沙眼衣原体数量不足或标本采集不当的缘故,结果判读客观性强，适宜于大样本沙眼衣原体感染的检测。 在沙眼衣原体高流行率的人群临床和健康体检；低流行率（小于5%）的人群中应用时，结果解释应慎重。,酶联免疫吸
17、附试验临床意义,抗原快速检测,1、 原理：利用免疫层析法原理，采用胶体金标记的沙眼衣原体抗体滤纸条或卡，快速检测标本中的沙眼衣原体抗原。 2、方法特点 简易，方便，快速，尤其适用于基层单位 标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原，否则有假阴性结果,抗原快速检测临床意义,该方法主要适用于女性患者宫颈标本的检测，敏感性较低。 该法快速、简便，无需特殊仪器，因此，较适合基层实验室开展。,核酸扩增检测,1、原理：核酸扩增技术是通过扩增沙眼衣原体的多拷贝基因（如隐蔽性质粒、染色体和RNA）检测病原体。 2、方法包括聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、等温链置换扩增技术（SDA）、转录介导扩增技术（TMA）等。目前国内广泛使用的有实时荧光PCR。,核酸扩增检测临床意义,核酸扩增检测具有很高的敏感性和特异性，世界卫生组织已推荐为扩大的生殖道沙眼衣原体感染实验室诊断的“金标准”。 核酸扩增检测不仅可用于宫颈、尿道标本中沙眼衣原体的检测，也可用于男女性尿液标本的检测。 开展核酸检测的实验室应通过有关部门考核取得开展临床核酸检测技术资格证。,方法评价,核酸检测是目前为止最好的检测方法但存在检测敏感性 上的局限性 ELISA抗原检测严格按操作说明进行操作是非常好的检测方法高通量，自动化 快速抗原检测操作时间短，单人份操作，但敏感性极低,敬请 批评指教！,
