1、28 中国奶牛20O6年第3期 牛冷冻精液生产过程中微生物含量的变化规律及控制措施 郝爱玲，阿淑艳，赵一丹，于香玲，朱蕾，段晓坤 (黑龙江省家畜繁育指导站，哈尔滨150069) 中图分类号：$8233+4文献标识码：B 文章编号：10044264(2006)0302802 微生物含量在牛冷冻精液的质量检查中是项极 为重要的指标因为被微生物严重污染的冷冻精液，精 子活力会降低生存时间将缩短，而且输精后极易造成 早期胚胎的死亡，从而降低受胎率。在新拟定的牛冷 冻精液国家标准(GB4143一xx)规定：牛冷冻精液解冻 后的精液无病原微生物，每剂冻精细菌数不超过800 个 为了在冻精生产中更好地控制冻
2、精的细菌含量我 们针对冻精生产中的每一环节即从采精、稀释、冷冻 等每一过程都进行了微生物检查试验从而找出了在 冻精生产中微生物的变化规律，并提出r控制细菌数 的相关措施 收稿H期：200511一l4 注：包括体内胚和体外胚。 裹4奶牛受体移植1枚和2枚IvF冻胚的产犊率比较 31移植季节 本试验在秋季移植体内冻胚和IVF冻胚的产犊率 分别为5000和2353说明亚热带地区在秋季开展 奶牛胚胎移植是可行的 但同时也存在秋季移植产犊 时间正值夏天炎热时节新生ET牛犊容易发生呼吸道 疾病给护理带来一定的麻烦和问题，需要从强化饲养 管理上下功夫同时有待进一步合理调整移植与产犊 时间。 32受体来源 选
3、择自然发情牛作为受体的数量有限而黄牛受 体同期发情率普遍低。由于亚热带黄牛受体体形小，饲 养管理较粗放。营养平衡较差符合标准的受体数量难 以保证同期发情处理效果不理想(本试验的同期发情 率仅为32oo)，并且移植后造成难产的可能性大(本 试验中黄牛受体未移植奶牛胚胎) 而规模饲养奶牛的 1试验方法 11培养基的制备 参照农业部牛冷冻精液质检中心最新制定的牛 冷冻精液质量检测规程有关内容进行制备。 12采精过程的细菌检测 选取黑龙江省家畜繁育指导站正常参加采精的 种公牛20头首先对其采精所要使用的20个假阴道 进行微生物检查将每个假阴道用事先已经灭菌好的 29柠檬酸钠等渗溶液20mL进行均匀冲洗
4、 在无菌 室用已灭菌吸量管吸取01mL冲洗液接种到事先准 备好的营养琼脂培养皿内然后放入37恒温培养箱 内培养48h后检查细菌菌落数。每毫升冲洗液中含菌 农户少，用奶牛作受体数量有限，受体牛来源不足是制 约规模化移植的重要原因 、 33同期发情与移植效果 奶牛的同期发情效果好于黄牛：自然发情牛的移 植产犊率较高于同期发情牛，但差异不显著。据王建国 等(2004)报道，移植前补充营养素(维生素、微量元素、 提高能量和蛋白类饲料水平)和不补充营养素的受体 移植IVF冻胚的产犊率分别为289(33114)和 1110(545)，二者问有显著差异。今后在同期发情处 理前应严格选择受体并加强饲养管理(如
5、适当补充精 料、维生素和矿物质等)以及采用更有效的同期发情处 理力法来提高效率 34移植胚胎数量与移植效果 移植2枚胚胎的产犊率较高于移植1枚的但差 异不显著。在同侧子宫移植2枚并没能明显提高产犊 率，建议移植1枚为宜，以提高胚胎的利用率。 参考文献 l11三村耕&森国琢磨著，方德罗，杨德祥，杨罗贞译1989，家畜管 理学M1j杭州，浙江科学技术出版丰十，6465 2l王建国，仓明，旭日甘等受体因素对牛F胚胎移植妊娠率影 响的研究A1，宁波：中国畜牧兽医学会动物繁殖分会第十_二届学 术研讨会论文集C1，2004，3 i 1-3 17 31崔守良，包利峰，牛体外胚胎移植的效果及问题探讨，草食家畜
6、， 2003(增)1 11 2口 维普资讯 http:/ 中国奶牛2006年第3期 29 量平均为217个。20mL冲洗液中所含细菌总量平均 为4323个。 对采精所用集精管、凡十林、蒸馏水进行微生物检 查。取20个集精管分别用已灭菌的29柠檬酸钠溶 液2Oral进行均匀冲洗，并取O1mL冲洗液进行接种 培养48h后检查菌落数每毫升冲洗液的细菌数平均 为42个20mL冲洗冲洗液中所含细菌总量平均为840 个：经检查凡七林每毫升的含菌量为8个：每毫升蒸馏 水的含茼量为130个 然后对所选取的2O头种公牛的原精进行微生物 检查。分别取01mL的原精液置于盛有09mL灭茼解 冻液的小试管内混均匀后再
7、取其混合液O1mL置于 盛有04mL解冻液的试管内经两步稀释混均匀后用 灭菌吸量管准确吸取O 1mL混合液进行接种培养每 毫升原精中的细菌菌落数平均为52876个 13稀释及冻精过程的细菌检测 对制做稀释液所用玻璃器材进行微生物检查 将 量筒、三角烧杯、漏斗等玻璃器材分别用已灭菌的29 柠檬酸钠20mL进行冲洗，并取01mL冲洗液进行接种 培养，其每毫升冲洗液细菌数平均是1O个。对稀释液 进行细菌含量的检查取01mL的稀释液接种培养每 毫升稀释液中含菌量为0个 对塑料细管的细菌检查 用一次性注射器吸取柠檬 酸钠溶液，注入细管中剪开细管另一端直接注入平皿中 培养，每个细管的含菌量平均为0个。对针
8、头胶管的检 查，用一次性注射器吸取柠檬酸钠溶液，从胶管端注入 从针头端接种lmL冲洗液其含菌量平均为100个 将上面的2O头牛经稀释、平衡、分装后的精液进 行微生物检查即在冷冻前将2O头牛的精液各取出2 支在无菌室内用输精枪头将精液推入平皿内，然后进 行培养每剂精液平均含菌量为598个。 对上面的2O头牛的冻精进行微生物检查检测方 法按最新颁布的牛冷冻精液质量检测规程进行，细 菌含量平均是每剂511个(以上所有微生物检测的细 菌培养时间都是48h)。 2结果分析与冻精生产中细菌数的控制措施 21控制原精的细茵污染 从对原精、分装后鲜精和冻精三组的微生物检测 结果可分为四种情况：原精细菌含量不高
9、冻精也不 高，这种情况占25(5头牛)；原精细菌含量高，冻精 不高，占40(8头牛)：原精细菌含量高，冻精细菌含 量也高，占30(6头牛)；原精细菌含量不高，但冻精 高占5(1头牛)。 以上检测结果可以说明精液主要是在原精这一环 节被污染的 而原精的污染主要为来自公牛包皮内的 大量微生物及假阴道的不清洁所造成所以采精时对 公牛阴茎包皮的清洗至关重要。有资料报道未清洗包 皮的公牛精液中的细菌数是清洗包皮的5 1O倍之多 为了减少污染在采精前必须将种公牛体表及包皮内 腔彻底冲洗干净并用消毒毛巾一对一擦拭干净 另外假阴道也是造成污染的一个重要凶素所以对 假阴道的消毒一定要彻底并在安装假阴道前先洗干净
10、 双手，用75的酒精棉球消毒假阴道内胎，而且假阴道 不能重复使用。做到一个假阴道只使用一次以免对精 液造成污染 恒温箱在放假阴道之前需用紫外线定期 灭菌。凡士林采取水浴煮沸消毒 从上面检测发现集精 管和蒸馏水污染比较严重所以要特别注意采精场的 卫生环境以减少对采精所用器具及蒸馏水的污染 原精细菌含量高，但冻精不高。这说明抗菌素、磁 场效应、甘油对原精中的细菌起到一定的抑制作用：而 原精中细菌数高冻精也高说明这头牛精液中本身的 细菌对抗菌素有一定的耐力。细菌的来源不同、种类不 同对抗菌素的耐力也不同。 22控制稀释液配制及冻精制做过程中的细菌污染 原精细菌数不高而冻精细菌数高则说明精液是 在处理
11、和分装等过程中被污染的 如果从稀释、平衡、 分装及实验室卫生等生产过程严格按照冷冻精液生 产技术操作规程进行，这种情况就完全可以避免。 从上面的检测中发现稀释液中并不含细菌。为了 保证配液过程不污染首先应改善实验室的卫生状况 冻精室应用紫外线灯消毒操作人员要保持个人卫生 工作服定期消毒灭菌：冻精制作时所用的耐高温器械 需经160C高温保持1h不耐高温的器械用75酒精 消毒。做稀释液所用蒸馏水要用双蒸馏水。而且做好的 稀释原液置75水浴锅中消毒30min 卵黄取自健康 鸡群的新鲜鸡蛋并用75酒精消毒蛋壳。一定要注意 鸡蛋的来源严格控制带菌蛋。因为稀释液的污染最大 的问题来源于卵黄 为了更好地控制
12、稀释液中的含菌 量可在稀释液中加入适量的抗菌素来抑制冻精中微 生物的生长繁殖。常用的有青霉素、链霉素，庆大霉素 等但抗菌素也不能添加过量。因过多加入抗菌素将会 影响冻精质量 对塑料细管、针头和胶管进行微生物的检查发现细管 不含微生物。细管在使用前可用紫外线消毒30min。但针头 和胶管却含有一定量的细菌所以这一环节还要加强清洗。 且在分装过程中尽量防止精液的污染 3小结 要使冻精细菌菌落数达到新”国标”所规定的每剂 冻精的细菌数在800个以下首先在冻精生产中要严 格按照牛冷冻精生产技术操作规程要求去做，并了 解冻精生产过程中微生物变化的规律，尽量避免原精 的污染并采取相关措施尽可能减少稀释和冻精过程 的污染 口 维普资讯 http:/
