1、 茯苓多糖的提取纯化及应用研究进展作者：张晓娟 唐洁 梁引库 张林生【摘要】 茯苓多糖为我国传统中药茯苓的主要有效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫力、抗氧化、降血糖血脂、保肝、催眠等作用，可用于医疗、保健等领域，具有广阔的开发应用前景。为进一步优化茯苓多糖的提取工艺，促进其开发应用，文章参考大量国内外文献，对近几年茯苓多糖的提取、纯化及其应用作一综述。【关键词】 茯苓多糖； 提取； 纯化； 应用Abstract：Pachyman is the main effective component of the traditional Chinese medicine Poria cocos.
2、 It has effect of antitumor, antivirus, enhancing immunity, antioxidant, hypoglycemic and reducing blood lipid, protecting liver and hypnosis ect. It can be used in the field of medical care and others, so it has wide development and application prospect. In order to further optimize the extracting
3、processes of pachyman and promoting its development and application,this article reviewed the extraction, purification and application of pachyman in recent years based on large quantity of domestic foreign literatures.Key words：Pachyman; Extraction; Purification; Application 自从 20 世纪 60 年代研究发现酵母细胞壁
4、多糖(zymosan)具有免疫增强以及抗肿瘤作用以来，人们对多糖的研究产生了极大的兴趣，尤其是其生物活性方面的研究。茯苓多糖（pachyman）是近年来研究较多的一种真菌多糖，来源于多孔菌科真菌茯苓的菌核，约占整个茯苓菌核干重的 70%90%1，其化学组成为（13）-D- 葡聚糖2。茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力、保肝、催眠、抗炎、消石等作用，可广泛应用于医疗保健、食品等领域。茯苓多糖可用于抗肿瘤药物的研发，从而为肿瘤、癌症的治疗提供新的方法，还可作为免疫增强剂，用于保健品的开发与研制。另外，羧甲基茯苓多糖具有水溶性及增稠性，可配制成各种保健食品。因此，茯苓多糖的提取及开发
5、意义重大。现将茯苓多糖的提取、纯化及应用综述如下。1 茯苓多糖的提取方法 茯苓多糖主要存在于茯苓细胞壁中，按照溶解度的不同又分为水溶性茯苓多糖和碱溶性茯苓多糖3。通常采用水提醇沉法、碱提醇沉法提取。 水溶性多糖的提取主要与提取次数、时间、固液比及温度等因素有关。随着提取次数增多，多糖的浸出率明显增高，但提取次数不易过多，一般为两次，否则，将造成后期工作量增大，提取成本过高。提取时间延长可提高多糖的浸出率，但浸提时间过长，将造成提取工艺延长。同时，还有可能增加杂质的溶出，通常选 3h。固液比也影响多糖的浸出，在保证浸出率的前提下，尽可能减少液体体积，以减少浓缩工作量。多糖的浸出率还与浸提温度有关
6、，随后者的升高而提高，但温度过高可能破坏多糖的结构，一般选择 80提取。碱溶性多糖的提取一般在 4下进行，其影响因素除以上几点外，还与碱浓度有关，常采用 0.5mol/L。在乙醇沉淀步骤中，浸提液浓缩比及乙醇加量是影响茯苓多糖沉淀率的主要因素4。1.1 水提醇沉法 称取一定量茯苓粉末热水浸提抽滤滤液减压浓缩(浸提液浓缩液=101) 95%乙醇沉淀（含醇量达 80%）于冰箱中静置过夜离心沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤真空干燥得茯苓多糖粗品4。该法采用水作为溶剂，具有价廉、无毒、操作安全等优点，其缺点是浸提时间长且提取率较低。1.2 稀碱浸提法 稀碱法浸提碱溶性茯苓多糖应注意，在提取结束后应迅速
7、用醋酸中和，以免多糖活性受影响4。取一定量茯苓粉末溶于 0.5 mol/L 稀碱液中， 4放置过夜，滤液以 10%的醋酸中和至中性，再加入 95%乙醇沉淀，以下步骤同水提醇沉法。该法提取率较水提醇沉法高，但浸提程序较繁琐，浸提条件较剧烈，极易破坏多糖的立体结构，使其生物活性受到限制。 1.3 酶+热水浸提法 该法通过外加酶降解茯苓的细胞壁，从而促进茯苓多糖的浸出。通常加入蛋白酶或植物复合酶，后者主要是由纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶等组成的混合酶系。陈莉4采用植物精提复合酶+热水浸提法提取茯苓多糖，在普通热水浸提基础上加入酶解步骤，通过改变酶加入量、酶解温度、酶解时间等因素将茯苓多糖的浸出率提高
8、到热水浸提法的 2.32 倍。黄才欢5采用有机溶剂预处理一木瓜蛋白酶水解加热水浸提法提取多糖，使得水溶性多糖的提取率明显提高，比常规浸泡水煮法的提取率约高 85%。酶解法可以在较低的温度下提高多糖的提取率，与传统的热水浸提法相比，浸提时间缩短，得率提高，是水溶性茯苓多糖提取的好方法。1.4 微波、超声波辅助提取法 微波提取法利用加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，从而使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进而出现裂纹，从而使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物6。聂金媛等7利用微波辅助法提取茯苓多糖，在微波占空比 42%，固液比为
9、150，提取时间 18 min 条件下，提取率达 2.792%，为传统水回流提取法的两倍。该法具有受热均匀、快速、高效、安全、节能等优点，近年来，普遍应用于多糖的提取。超声波提取技术也是近年来发展起来的一种提取生物活性物质的方法，具有方便、快速、提取物活性高的特点。赵声兰等8采用超声波法提取茯苓多糖，但提取率不高，最高达到 1.6%。1.5 发酵醇沉法 发酵醇沉法提取茯苓多糖包括胞外多糖的提取及胞内多糖的提取，前者将发酵液离心得上清液，浓缩至一定体积，乙醇沉淀，将沉淀物用丙酮、乙醚洗涤，得胞外多糖。后者包括胞内水溶性多糖及碱溶性多糖的提取。水溶性多糖的提取:取有机溶剂处理（脱脂）后的茯苓菌丝体
10、粉末采用水提醇沉法进行提取；碱溶性多糖的提取:将上述提取水溶性多糖后的菌丝体滤渣用 5 倍量0. 5 mol/L 的 NaOH 浸提，步骤同稀碱浸提法。 液体发酵具有易于操作、节约资源、产率高、周期短、可大规模投入工业生产等优点，已逐渐成为获取茯苓多糖的主要方法9。但研究表明10，发酵茯苓菌丝体中总多糖的提取率较天然茯苓低，这可能因为发酵茯苓菌丝体多糖的提取工艺不完善，有待进一步优化，也可能由于发酵茯苓菌丝体中总多糖占总糖的比例低于天然茯苓。2 茯苓多糖纯化方法 茯苓多糖提取之后，经常混有蛋白质、色素、低聚糖等杂质，需对其进行除杂纯化，所得茯苓多糖为粗多糖，是多糖的混合物，化学组成不均一，可通
11、过季胺盐沉淀法、分步沉淀法、凝胶层析法、超滤分级等方法分离纯化，成为单一组分多糖。一般多采用二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素法和其它不同类型的凝胶层析法11。2.1 蛋白质的去除方法 多糖中去除蛋白质的方法常见的有Severge 法、三氯乙酸法、鞣酸沉淀法、蛋白酶水解法等。2.1.1 Severge 法根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，从而去除蛋白。按多糖水溶液体积的 1/41/3 加入氯仿：戊醇(正丁醇)=51，剧烈振摇 2030 min，除去含有蛋白质的氯仿和正丁醇混合液。该法条件温和，可避免多糖的降解，但除蛋白质效率不高。另外，在多糖的水提液中加入中性蛋白酶，与 Severge
12、法结合脱蛋白，效果较好。2.1.2 三氯乙酸法向多糖溶液加入 1/5 体积 10%的三氯乙酸溶液磁力搅拌 3Omin，离心去除沉淀，用 3 倍体积的 95%的乙醇沉淀，3 000r/min 离心 15min，沉淀加原来多糖溶液体积的 1/5 的水溶解，加入 1/5 体积 10%三氯乙酸溶液，方法同上，处理 3 次，所得溶液用 95%乙醇沉淀。此法缺点是易引起某些多糖的降解。2.1.3 鞣酸沉淀法利用鞣酸与蛋白反应生成沉淀的原理除蛋白。孔祥辉等12在微沸状态下，向多糖溶液中滴加 1%的鞣酸溶液，直至无沉淀产生为止。离心取上清液，再滴加 1%的鞣酸溶液，直至无沉淀产生为止，取上清液，浓缩，醇沉。此
13、法的缺点是易引起某些多糖的降解。2.2 茯苓多糖的脱色 多糖中常含有色素(游离色素或结合色素) 。常用的脱色方法有：双氧水氧化法、离子交换法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)。双氧水是一种氧化剂，使用时浓度应控制在 30%左右，其脱色耗时长，脱色不完全，有可能影响多糖的生物活性。离子交换纤维素和离子交换树脂能取得较好的脱色效果，但色素洗脱困难，难以重新获得交换能力。通常用活性炭吸附，但此法易造成多糖的损失，所以一般用弱碱性树脂、DEAE 纤维素吸附色素。通过离子交换柱不仅能达到脱色的目的，而且可以进行分离13，其缺点为色素的洗脱较耗时。2.3 透析除小分子杂质 该法利用一定大小
14、孔目的膜，使茯苓多糖中的无机盐或小分子糖透过从而达到分离的目的。透析在逆相流水中进行，pH 值保持在 6.06.5。操作时将需要处理的茯苓多糖于双蒸水中过夜溶胀后，置于半透膜透析袋中，双蒸水透析，透析液浓缩后用乙醇沉淀多糖4。2.4 大孔吸附树脂纯化茯苓多糖 大孔吸附树脂是一类不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂，其多孔性网状空穴可较好的吸附多糖中的杂质，主要用于分离、脱无机盐、浓缩及除去有机杂质。李玲14应用大孔树脂纯化茯苓多糖，取得了较好的效果。该法具有吸附量大、选择性好、吸附速度快、易于解吸附、机械强度高、再生处理简便等优点。3 茯苓多糖的应用3.1 茯苓多糖在抗肿瘤方面的应用 茯苓
15、多糖具有抗肿瘤作用，可用于抗肿瘤药物的研发，具有毒副作用低的特点。 研究表明15，茯苓多糖可诱导 S180 肉瘤细胞的凋亡，其效果与茯苓多糖的浓度和作用时间有关。对茯苓多糖进行修饰或衍生化处理，可提高其抗肿瘤活性，且活性与剂量和给药途径相关。茯苓多糖抗肿瘤机理与细胞膜生化特性的改变有关，其影响膜的肌醇磷脂代谢，抑制磷脂酰肌醇通路中的 PI 转化，阻断通路中下游信使分子间的信息下传，从而抑制肿瘤细胞增殖3。茯苓多糖抗肿瘤作用是通过增强机体免疫力、激活监视系统实现的1618。它可提高肿瘤小鼠体内肿瘤坏死因子（TNF）的活性，后者通过直接参与单核细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制瘤基因的转录实现抗肿瘤作用1
16、9。 刘吉成等20研究表明，含茯苓多糖的复合多糖与化疗药物环磷酰胺联合对抑制移植性肿瘤 S180 具有显著的增效作用。羧甲基茯苓多糖（CMP）、硒与环磷酰胺合用后具有协同抗癌作用，通过下调bcl-2 基因的表达、诱导癌细胞凋亡，从而延长荷瘤小鼠的生存期，同时减轻化疗药物的毒副作用21。因此，可将茯苓多糖与化疗技术配合，用于临床上治疗恶性肿瘤22。3.2 茯苓多糖在免疫增强方面的应用 茯苓多糖具有增强免疫功能的作用，它可保护免疫器官，抗胸腺萎缩、抗脾脏增大和抑瘤生长。 因此，可作为免疫增强剂，用于提高机体免疫力。陈春霞23研究表明，羧甲基茯苓多糖能明显增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,明显增加
17、小鼠脾抗体分泌细胞数(PFC)以及特异的抗原结合细胞数(SRFC), 明显增强小鼠对牛血清白蛋白 (BSA)诱导的迟发型超敏反应(DTH),明显增强小鼠脾 T 细胞生长因子(TCGF) 的生长,这可能是其增强免疫应答功能及抑瘤率的机制之一。 张秀军等24研究表明羧甲基茯苓多糖（CMP）体内外给药均可显著增强小鼠免疫功能。韩凌等25研究多糖对大鼠小肠上皮细胞株 IEC-6 细胞增殖的影响发现，茯苓多糖具有明显的促进细胞生长的作用，由于小肠上皮细胞被认为在宿主黏膜表面的天然及获得性免疫系统中起中心调节作用，因而，该研究提示茯苓多糖具有促进机体免疫的作用。刘媛媛等26研究表明 CMP 能显著提高 I
18、FN- 水平，降低 IL-10 含量，具有较好的调节 Th1/Th2 细胞因子分泌作用，从而提高机体免疫力。 对茯苓多糖增强免疫的机制表明，茯苓多糖通过产生毒因子、释放溶酶体酶、与淋巴细胞协同破坏抗原和癌细胞、合成和释放干扰素、消除组织变态等反应完成3。它还可激活 T、 B 淋巴细胞，从而增强机体的细胞免疫和体液免疫。3.3 茯苓多糖在抗衰老方面的应用 侯安继等27研究发现，茯苓多糖能不同程度增加血清中超氧化物歧化酶（T-SOD 和 Cu-SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量。SOD 可清除体内自由基， MDA 含量降低反应体内自由基累积水平下降，因此，该实验提示茯苓多糖具有清除自由基作用，
19、从而抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。因而，茯苓多糖可用于中老年保健品的研发，起到延年益寿之功效。3.4 茯苓多糖在抗病毒方面的应用 茯苓多糖具有抗病毒作用，可用于抗病毒药物的研发，从而治疗各种病毒病。杨吉成等28研究表明，1001 000 g/ml 的 CMP 预处理的人胚肺细胞，具有抗滤泡性口腔炎病毒的作用。张信岳等29研究发现羧甲基茯苓多糖钠（2.0 mg/ml）对单纯疱疹病毒 I 型（ HSV-1）的致猪肾传代细胞的细胞病变(CPE)具有抑制作用，提示 CMP 钠在体外有抗 HSV-1作用。段会平等30研究 CMP 在人肝癌细胞抗乙型肝炎病毒(HBV)中的作用表明，
20、CMP 对 HBV 表面抗原(HBsAg)和 e 抗原(HBeAg)的分泌具有较好的抑制作用。3.5 茯苓多糖在防辐射方面的应用研究证明，许多多糖对各种电离射线照射后的动物有明显的防护作用。范雁等31研究茯苓多糖对受 60Co 射线照射后 K562 白血病细胞及细胞培养上清液自由基的影响，发现茯苓多糖可引起照射后细胞中 MDA 含量降低，但仍明显高于未照射组。茯苓多糖对照射后肿瘤细胞自由基活性无显著影响。由此可推测茯苓多糖对正常细胞辐射防护作用的同时基本不会影响放疗的效果。因此，可用作新的临床抗辐射损伤药物，具有来源丰富、作用广泛、对机体几乎无毒副作用等优点。应用前景广阔。3.6 茯苓多糖在其
21、它方面的应用 茯苓多糖还具有抗炎、消石、防肾功能衰竭、保肝、催眠等作用。对其进行开发利用，制备各种茯苓多糖产品，如茯苓多糖制剂、口服液等，已广泛用于医疗保健行业。 侯安继等32研究茯苓多糖对二甲苯所致小鼠急性炎症和无菌棉球所致大鼠慢性炎症实验表明，茯苓多糖具有抑制急、慢性炎症反应作用。陈焱等33研究发现茯苓多糖能有效抑制大鼠肾内草酸钙结晶的形成和沉积，具有较好的防石作用，可用于临床上结石病的治疗。李绪亮等34研究硫酸酯化茯苓多糖（SP）对慢性肾功能衰竭大鼠肾功能指标及肾脏形态的影响表明，硫酸酯化茯苓多糖对大鼠慢性肾功能衰竭具有防治作用。CMP 具有保肝作用，它可降低四氯化碳中毒小鼠血清谷丙转氨
22、酶活性，保护肝功能，CMP 还可促进部分肝切除大鼠的肝再生，并且再生肝重量增加35。另外，其对肝硬化、慢性迁延性肝炎有较好的疗效 36。此外，CMP 还具有催眠作用。4 结语 近些年，随着医药、化学以及生物学的不断发展，茯苓多糖的提取纯化、药理学以及应用研究取得了很大进展。酶+热水浸提法显著提高了茯苓多糖的提取率，同时，缩短了提取时间。然而，水溶性多糖的提取率仍较低，一般不超过 6%，因此，有必要进一步改进茯苓多糖的提取工艺，提高提取率。同时，应深入研究液体发酵生产茯苓多糖的方法，从而节约茯苓资源，适应大规模工业化生产的要求。茯苓多糖的开发研究意义重大，具有广阔的前景。其在医疗保健领域的应用已
23、取得一定进展。茯苓多糖对鼻咽癌和胃癌等患者有一定的疗效，在国外，20 世纪 70 年代已将其作为抗癌剂，投入市场；它还可作为一种免疫调节剂，毒副作用低，特别引人注目的是羧甲基茯苓多糖不仅是低浓度干扰素的诱生剂，而且是理想的干扰素促生剂，可提高单位细胞干扰素的产量4；茯苓多糖用于开发各种保健食品，具有“天然、营养、保健” 的优点。然而，茯苓多糖及其衍生物的开发应用，目前仍处于研究阶段,还存在不少问题，应深入研究以提高其生物活性，降低毒副作用4。另外，目前关于茯苓多糖结构与功能的关系、结构的测定方法、合成、其在体内的作用机制等一些问题仍有待进一步研究。本文主要论述了近些年茯苓多糖提取纯化及应用研究，为其今后的开发利用提供参考。【
