1、1人 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 酶 联 免 疫 分 析试 剂 盒 使 用 说 明 书本 试 剂 仅 供 研 究 使 用 目 的 ： 本 试 剂 盒 用 于 测 定 人 血 清 ， 血 浆 及 相 关液 体 样 本 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 的 活 性 。实 验 原 理 ：本 试 剂 盒 应 用 双 抗 体 夹 心 法 测 定 标 本 中 人 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 水 平 。 用 纯 化 的 人 超氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 抗 体 包 被 微 孔 板 ， 制 成 固 相 抗 体 ， 往 包 被 单 抗 的 微 孔 中 依 次 加
2、 入 超氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） ， 再 与 HRP 标 记 的 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 抗 体 结 合 ， 形 成 抗 体 -抗原 -酶 标 抗 体 复 合 物 ， 经 过 彻 底 洗 涤 后 加 底 物 TMB 显 色 。 TMB 在 HRP 酶 的 催 化 下 转 化 成 蓝色 ， 并 在 酸 的 作 用 下 转 化 成 最 终 的 黄 色 。 颜 色 的 深 浅 和 样 品 中 的 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD）呈 正 相 关 。 用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 （ OD 值 ） ， 通 过 标 准 曲 线 计 算
3、 样 品 中 人 超氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 活 性 浓 度 。试 剂 盒 组 成 ：试 剂 盒 组 成 48 孔 配 置 96 孔 配 置 保 存说 明 书 1 份 1 份封 板 膜 2 片 （ 48） 2 片 （ 96）密 封 袋 1 个 1 个酶 标 包 被 板 1 48 1 96 2-8 保 存标 准 品 ： 720U/L 0.5ml 1 瓶 0.5ml 1 瓶 2-8 保 存标 准 品 稀 释 液 1.5ml 1 瓶 1.5ml 1 瓶 2-8 保 存酶 标 试 剂 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8 保 存样 品 稀 释 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶
4、2-8 保 存显 色 剂 A 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8 保 存显 色 剂 B 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8 保 存终 止 液 3ml 1 瓶 6ml 1 瓶 2-8 保 存浓 缩 洗 涤 液 （ 20ml 20 倍 ） 1 瓶 （ 20ml 30 倍 ） 1 瓶 2-8 保 存样 本 处 理 及 要 求 ：1. 血 清 ： 室 温 血 液 自 然 凝 固 10-20 分 钟 ， 离 心 20 分 钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上清 ， 保 存 过 程 中 如 出 现 沉 淀 ， 应 再 次 离 心 。2. 血 浆
5、： 应 根 据 标 本 的 要 求 选 择 EDTA 或 柠 檬 酸 钠 作 为 抗 凝 剂 ， 混 合 10-20 分 钟 后 ， 离 心20 分 钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上 清 ， 保 存 过 程 中 如 有 沉 淀 形 成 ， 应 该 再 次离 心 。3. 尿 液 ： 用 无 菌 管 收 集 ， 离 心 20 分 钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上 清 ， 保 存 过 程中 如 有 沉 淀 形 成 ， 应 再 次 离 心 。 胸 腹 水 、 脑 脊 液 参 照 实 行 。24. 细 胞 培 养 上 清 ：
6、 检 测 分 泌 性 的 成 份 时 ， 用 无 菌 管 收 集 。 离 心 20 分 钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上 清 。 检 测 细 胞 内 的 成 份 时 ， 用 PBS（ PH7.2-7.4） 稀 释 细 胞 悬 液 ， 细 胞浓 度 达 到 100 万 /ml 左 右 。 通 过 反 复 冻 融 ， 以 使 细 胞 破 坏 并 放 出 细 胞 内 成 份 。 离 心 20 分钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上 清 。 保 存 过 程 中 如 有 沉 淀 形 成 ， 应 再 次 离 心 。5. 组 织 标
7、 本 ： 切 割 标 本 后 ， 称 取 重 量 。 加 入 一 定 量 的 PBS， PH7.4。 用 液 氮 迅 速 冷 冻 保 存 备用 。 标 本 融 化 后 仍 然 保 持 2-8 的 温 度 。 加 入 一 定 量 的 PBS（ PH7.4） ， 用 手 工 或 匀 浆 器将 标 本 匀 浆 充 分 。 离 心 20 分 钟 左 右 （ 2000-3000 转 /分 ） 。 仔 细 收 集 上 清 。 分 装 后 一 份 待检 测 ， 其 余 冷 冻 备 用 。6. 标 本 采 集 后 尽 早 进 行 提 取 ， 提 取 按 相 关 文 献 进 行 ， 提 取 后 应 尽 快 进
8、行 实 验 。 若 不 能 马 上进 行 试 验 ， 可 将 标 本 放 于 -20 保 存 ， 但 应 避 免 反 复 冻 融 .7. 不 能 检 测 含 NaN3 的 样 品 ， 因 NaN3 抑 制 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 （ HRP） 活 性 。操 作 步 骤 ：1. 标 准 品 的 稀 释 与 加 样 ： 在 酶 标 包 被 板 上 设 标 准 品 孔 10 孔 ， 在 第 一 、 第 二 孔 中 分 别 加 标准 品 100l， 然 后 在 第 一 、 第 二 孔 中 加 标 准 品 稀 释 液 50l， 混 匀 ； 然 后 从 第 一 孔 、 第 二孔 中 各 取 100
9、l 分 别 加 到 第 三 孔 和 第 四 孔 ， 再 在 第 三 、 第 四 孔 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50l，混 匀 ； 然 后 在 第 三 孔 和 第 四 孔 中 先 各 取 50l 弃 掉 ， 再 各 取 50l 分 别 加 到 第 五 、 第 六 孔中 ， 再 在 第 五 、 第 六 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50ul， 混 匀 ； 混 匀 后 从 第 五 、 第 六 孔 中 各取 50l 分 别 加 到 第 七 、 第 八 孔 中 ， 再 在 第 七 、 第 八 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50l， 混匀 后 从 第 七 、 第 八
10、孔 中 分 别 取 50l 加 到 第 九 、 第 十 孔 中 ， 再 在 第 九 第 十 孔 分 别 加 标 准品 稀 释 液 50l， 混 匀 后 从 第 九 第 十 孔 中 各 取 50l 弃 掉 。 （ 稀 释 后 各 孔 加 样 量 都 为 50l，浓 度 分 别 为 480 U/L， 320U/L ， 160U/L， 80U/L， 40U/L） 。2. 加 样 ： 分 别 设 空 白 孔 （ 空 白 对 照 孔 不 加 样 品 及 酶 标 试 剂 ， 其 余 各 步 操 作 相 同 ） 、 待 测 样品 孔 。 在 酶 标 包 被 板 上 待 测 样 品 孔 中 先 加 样 品 稀
11、 释 液 40l， 然 后 再 加 待 测 样 品 10l（ 样品 最 终 稀 释 度 为 5 倍 ） 。 加 样 将 样 品 加 于 酶 标 板 孔 底 部 ， 尽 量 不 触 及 孔 壁 ， 轻 轻 晃 动 混匀 。3. 温 育 ： 用 封 板 膜 封 板 后 置 37 温 育 30 分 钟 。4. 配 液 ： 将 30（ 48T 的 20 倍 ） 倍 浓 缩 洗 涤 液 用 蒸 馏 水 30（ 48T 的 20 倍 ） 倍 稀 释 后 备 用 。5. 洗 涤 ： 小 心 揭 掉 封 板 膜 ， 弃 去 液 体 ， 甩 干 ， 每 孔 加 满 洗 涤 液 ， 静 置 30 秒 后 弃 去
12、， 如 此重 复 5 次 ， 拍 干 。6. 加 酶 ： 每 孔 加 入 酶 标 试 剂 50l， 空 白 孔 除 外 。7. 温 育 ： 操 作 同 3。8. 洗 涤 ： 操 作 同 5。9. 显 色 ： 每 孔 先 加 入 显 色 剂 A50l， 再 加 入 显 色 剂 B50l， 轻 轻 震 荡 混 匀 ， 37 避 光 显 色15 分 钟 .10. 终 止 ： 每 孔 加 终 止 液 50l， 终 止 反 应 （ 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 ） 。11. 测 定 ： 以 空 白 空 调 零 ， 450nm 波 长 依 序 测 量 各 孔 的 吸 光 度 （ OD 值 ） 。 测 定
13、 应 在 加 终 止液 后 15 分 钟 以 内 进 行 。注 意 事 项 ：1 试 剂 盒 从 冷 藏 环 境 中 取 出 应 在 室 温 平 衡 15-30 分 钟 后 方 可 使 用 ， 酶 标 包 被 板 开 封 后 如 未用 完 ， 板 条 应 装 入 密 封 袋 中 保 存 。2 浓 洗 涤 液 可 能 会 有 结 晶 析 出 ， 稀 释 时 可 在 水 浴 中 加 温 助 溶 ， 洗 涤 时 不 影 响 结 果 。3 各 步 加 样 均 应 使 用 加 样 器 ， 并 经 常 校 对 其 准 确 性 ， 以 避 免 试 验 误 差 。 一 次 加 样 时 间 最 好3控 制 在
14、5 分 钟 内 ， 如 标 本 数 量 多 ， 推 荐 使 用 排 枪 加 样 。4 请 每 次 测 定 的 同 时 做 标 准 曲 线 ， 最 好 做 复 孔 。 如 标 本 中 待 测 物 质 含 量 过 高 （ 样 本 OD 值大 于 标 准 品 孔 第 一 孔 的 OD 值 ） ， 请 先 用 样 品 稀 释 液 稀 释 一 定 倍 数 （ n 倍 ） 后 再 测 定 ， 计算 时 请 最 后 乘 以 总 稀 释 倍 数 （ n 5） 。5 封 板 膜 只 限 一 次 性 使 用 ， 以 避 免 交 叉 污 染 。6 底 物 请 避 光 保 存 。7 严 格 按 照 说 明 书 的 操
15、 作 进 行 ， 试 验 结 果 判 定 必 须 以 酶 标 仪 读 数 为 准 .8 所 有 样 品 ， 洗 涤 液 和 各 种 废 弃 物 都 应 按 传 染 物 处 理 。9 本 试 剂 不 同 批 号 组 分 不 得 混 用 。10. 如 与 英 文 说 明 书 有 异 ， 以 英 文 说 明 书 为 准 。计 算 ：以 标 准 物 的 浓 度 为 横 坐 标 ， OD 值 为 纵 坐 标 ，在 坐 标 纸 上 绘 出 标 准 曲 线 ， 根 据 样 品 的 OD值 由 标 准 曲 线 查 出 相 应 的 浓 度 ； 再 乘 以 稀 释倍 数 ； 或 用 标 准 物 的 浓 度 与 O
16、D 值 计 算 出 标准 曲 线 的 直 线 回 归 方 程 式 ， 将 样 品 的 OD 值代 入 方 程 式 ， 计 算 出 样 品 浓 度 ， 再 乘 以 稀 释倍 数 ， 即 为 样 品 的 实 际 浓 度 。 （ 此 图 仅 供 参 考 ）试 剂 盒 性 能 ：1.样 品 线 性 回 归 与 预 期 浓 度 相 关 系 数 R 值 为 0.95 以 上 。2.批 内 与 批 间 应 分 别 小 于 9%和 11%检 测 范 围 ：20U/ L -600U/ L保 存 条 件 及 有 效 期 ：1.试 剂 盒 保 存 ： ； 2-8 。2 有 效 期 ： 6 个 月4Human Sup
17、er Oxidase DimutaseFOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGeneric Name： Human Super Oxidase Dimutase (SOD) ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of SOD activity in Human serum, blood plasma, andother biological fluids.Principle of the assayThe kit assay Human SOD level in the sample, use Pu
18、rified Human SOD antibody to coatmicrotiter plate wells, make solid-phase antibody, then add SOD to wells, Combined SODantibody which With HRP labeled, become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, afterwashing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRPenzy
19、me-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and thecolor change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. Theconcentration of SOD in the samples is then determined by comparing the O. D. of the samplesto the standard curve.5Materials provided
20、 with the kitMaterials provided withthe kit 48determinations 96 determinations StorageUser manual 1 1Closure plate membrane 2 2Sealed bags 1 1Microelisa stripplate 1 1 2-8Standard： 720U/ L 0. 5ml1 bottle 0. 5ml1 bottle 2-8Standard diluent 1. 5ml1 bottle 1. 5ml1 bottle 2-8HRP-Conjugate reagent 3ml1 b
21、ottle 6ml1 bottle 2-8Sample diluent 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8Chromogen Solution A 3ml1 bottle 6ml1 bottle2-8Chromogen Solution B 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8Stop Solution 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8wash solution （ 20ml 20 fold） 1bottle （ 20ml 30 fold） 1bottle 2-8Specimen requirements1. serum- coagu
22、lation at room temperature 10-20 mins， centrifugation 20-min at the speed of2000-3000 r. p. m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2. plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r. p. m. remo
23、ve supernatant, Ifprecipitation appeared, Centrifugal again.3. Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r. p. m.remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation ofHydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4. cell
24、culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r. p. m. remove supernatant,detect thecomposition of cells, Dilut cell suspension with PBS（ PH7. 2-7. 4） , Cell concentrationreached 1 million / ml, repeated freeze-thaw c
25、ycles, damage cells and release ofintracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r. p. m. remove6supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5. Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（ PH7. 2-7. 4） , Rapidlyfrozen with liquid nitrogen,
26、 maintain samples at 2-8 after melting,add PBS（ PH7. 4） ,Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r. p. m.remove supernatant.6. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as p
27、ossible after the extraction. If it cant,specimen can be kept in -20 to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.7. Cant detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.Assay procedure1. Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, ad
28、dStandard 100l to the first and the second well, then add Standard dilution 50l to the first andthe second well, mix; take out 100l form the first and the second well then add it to the thirdand the forth well separately. then add Standard dilution 50l to the third and the forthwell ,mix ; then take
29、 out 50l from the third and the forth well discard, add 50l to the fifth andthe sixth well ,then add Standard dilution 50l to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50lfrom the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standarddilution 50l to the seventh and
30、 the eighth well ,mix ; take out 50l from the seventh and theeighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50l to the ninth andthe tenth well, mix , take out 50l from the ninth and the tenth well discard(add Sample 50l toeach well after Diluting ,(density: 480 U/L， 320U/
31、L ， 160U/L， 80U/L， 40U/L)2. add sample： Set blank wells separately (blank comparison wells dont add sample andHRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sampledilution 40l to testing sample well, then add testing sample 10l (sample final dilution is5-fold), a
32、dd sample to wells , dont touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3. Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37 .4. Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilledwater and reserve.5. washing：
33、Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer7to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6. add enzyme： Add HRP-Conjugate reagent 50l to each well, except blank well.7. incubate： Operation with 3.8. washing： Operation with 5.9. color： Add C
34、hromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade thelight preservation for 15 min at 3710. Stop the reaction： Add Stop Solution50l to each well, Stop the reaction(the blue colorchange to yellow color).11. assay： take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Sto
35、p Solution andwithin 15min.Important notes1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate shouldbe stored in Sealed bag.2. washing buffer will Crystallization separation, it
36、 can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3. add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much ,recommend to use Volley .4. if the testing mat
37、erial content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilutionfactor. （ n5） .5. Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6. The substrate evade the lig
38、ht preservation.7. Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8. All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.89. Do not mix reagents with those from other lots.Ca
39、lculateAssay range20U/ L -600U/ LStorage and validity1 Storage： 2-8 .2 validity： six months.Take the standard density as the horizontal, the ODvalue for the vertical ,draw the standard curve on graphpaper, Find out the corresponding density according to thesample OD value by the Sample curve, multip
40、lied by thedilution multiple, or calculate the straight line regressionequation of the standard curve with the standard density andthe OD value ,with the sample OD value in the equation,calculate the sample density, multiplied by the dilution factor,the result is the sample actual density. This chartis for reference only
