1、1、灭菌方法2、培养基的湿热灭菌 对数残留定律 阿仑尼乌斯定律3、分批灭菌,上节回顾,在发酵罐体积越来越大的今天，分批灭菌的对培养基成分破坏大、升降温时间长这一缺点就更为突出。而以“高温、快速”为特征的连续灭菌能够很好的避免了这一缺点。 连续灭菌：就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。,三、 培养基的连续灭菌,连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度(130140)，短时间保温(58 min)后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。,培养基连续灭菌过程中温度的变化,连续灭菌的设备流程图如图56：,图56培养基连续灭菌设备流程,连续灭菌注意事项：
2、 发酵罐应预先前先进行空罐灭菌。加热器、维持罐及冷却器也应先行灭菌。 培养基的不同成分(耐热与不耐热、糖与氮源)可在不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。,高温对培养基成分的有害影响,形成沉淀物 有机物：如多肽类沉淀 无机物：如磷酸盐、碳酸盐等沉淀破坏营养，提高色泽 褐变：产生氨基糖、焦糖或黑色素改变培养基的pH（一般为降低pH）降低培养基浓度（气温低时会增加冷凝水）,消除高温对有害影响的措施,采用特殊加热灭菌法（连续灭菌方法）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀对含有
3、在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌,连续灭菌和分批灭菌优缺点比较,分批灭菌和连续灭菌对维生素B12收率的影响,相反，高浓度盐类、色素等的存在会削弱微生物细胞的耐热性，故一般较易灭菌。,此外，还与微生物细胞的菌龄、耐热性、空气排除情况、搅拌等因素有关。,培养基灭菌具体采用那一种灭菌方式，应视培养基的成分、体积，结合当地蒸汽、发酵罐、场地等情况，分析两种灭菌法的优缺点而确定。 一旦确定采用连续灭菌，也要考虑到万一蒸汽压力不够时和灭菌不透时改用分批灭菌的设备余量。,连续灭菌的操作单元： 配料、预热、加热、保温、降温。,(1)、配料 配料罐用于培养基的配制。 然后将培养基用泵
4、打入预热桶中。,(2)、预热 预热桶的作用：定容、预热。 预热的目的：使培养基在后续的加热过程中能快速地升温到指定的灭菌温度，同时可避免太多的冷凝水带入培养基，还可减少震动和噪声。 一般可将培养基预热到7090。,(3)、加热 预热好的培养基由连消泵打入加热器。 加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。 加热采用的蒸汽压力一般为0.450.8 MPa，加热器有塔式加热器和喷射式加热器两种见图57。 加热的目的：使培养基在较短的时间(2030 s)里快速升温。,图57 ；连续灭菌的加热设备,进,设培养基流量为G，m3s；进入加热器的温度为tp。；灭菌温度为t；由热量平衡得加热蒸汽
5、用量为,：为培养基的密度，kgm3；C：培养基的比热容，Jkg；CW：水的比热容，Jkg：加热蒸汽的热焓，Jkg。,a塔式加热器 塔式加热器由一根多孔蒸汽管和一根套管组成。多孔管孔径58mm，小孔总截面积应等于或小于管截面积。小孔以管壁成45o夹角开设，上稀下密，以使蒸汽能均匀地从小孔喷出。 培养基由下端进入，在内外管环隙内流动，流速0.1 ms左右。与蒸汽激烈混合而加热。塔的有效高度为23 m，料液在加热塔里停留2030 s。,b喷射式加热器 国内大多数工厂采用。 优点：加热速度快、震动小、噪音低。 物料从中间管进，蒸汽从进料管周围的环隙进，在喷嘴出口快速均匀混合。喷射出口处设有拱形挡板的扩
6、大管，使混合更充分。受热后的培养基则从扩大管顶部排出。,(4)、保温 保温是将培养基维持灭菌温度一段时间，是杀灭微生物的主要过程。 其设备有维持罐和管式维持器两种。 保温设备一般用保温材料包裹，但不直接通入蒸汽。,a维持罐 维持罐如图58所示，,图58 维持罐结构,维持罐缺点： 维持罐直径比进料管直径大得多，培养基不能先进先出，返混较重，维持时间被迫延长，加剧了营养成分破坏。,连续灭菌的理论灭菌时间计算可沿用对数残留定律，如忽略升温的灭菌作用，得停留时间,5-26,C0：单位体积培养基在灭菌前活微生物个数，菌数毫升 Cs：单位体积培养基在灭菌后活微生物个数，菌数毫升,例5-3: 若将例51中的
7、培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131oC，此温度下的灭菌速度常数为0.25 s1，求灭菌保温时间。,由该例可见，灭菌温度升高10o C后采用连续灭菌则保温时间大为缩短。 当然，在维持罐内的物料会有返混，为保险起见，实际维持时间常取理论灭菌时间的35倍。,b管式维持器 管式维持器常做成蛇管状，外面用保温材料包裹。,管式维持器原理： 培养基在管道内处于湍流区，流体各质点流速几乎相等，处于活塞流状态，返混值为零。 这样既保证达到灭菌要求，又最大限度地避免了营养成分的破坏。,例5.4 有40m3培养基，密度为1000 kgm3，黏度为310-3Pas。如以14 m3s的流量进行连续灭菌，灭菌温度为135。设灭菌前培养基含菌量为107个mL，灭菌后允许残留量为0.001个。若用管式维持器保温，请设计其主要结构尺寸。,解： 设Pe1000， 0.5m/s取1084的无缝钢管，d0.1m。把各数据代入相应的公式，计算可得其设计主要结构尺寸。 如果校核Pe1000，重新设定。,(5)、降温 升降温快是培养基连续灭菌的重要特征之一。 为避免营养成分的破坏，培养基需要迅速降温至接近培养温度(4045)。 现国内大多采用喷淋冷却器，也有的采用螺旋板换热器、板式换热器、真空冷却器等。,
