1、染色体分带技术（生命科学学院 05 级应生 杨绍友 054120211 ）摘要：染色体是细胞遗传的物质基础，它对生物的发育、遗传、变异、进化和增殖等过程的调节和控制都具有极大的意义。关键词： 染色体；技术；分带；应用染色体显带(chrorm)me bancling)是一项借助某些特殊的染色程序使染色体在一定部位内显现出深浅不一的带纹的细胞学技术.由十特定染色体有其特定的带纹，因此显带可作为鉴别单个染色体和染色体组的手段，从而可以深入地认识个别染色体做出染色体组的带型。研究、记载染色体核型已有 100 多年历史，但对染色体本身进行深入细致灼分析，是近 50 年才发展起来。低渗处理和空气干燥制片法
2、的发明.组织培养和秋水仙素的仗用.带来了 60 年代动物和人类细胞遗传学的繁荣时期。这个时期染色体面临的生a 间题是:许多动物核型中染色体的大小，形态很相似，难于精确区分，而手头可用的鉴别标准又屈指可数，不外是染色体长度、着丝.载位毅、次级痕的多少和分布等等。即使采用放射自显影或借助电子汁其机牢染色体旧像分析，帮助也不大。染色体分带研究自然地成了主攻方向。此时，瑞典灼aspersso。采用特殊的荧光染料，使染色体分化染色，在荧光显微镜下显示出清晰的带纹。嗣后纷至踏来的各种分带技术相继出现，为染色体的精确鉴别提供了一条崭新的途径。在此将丛以下几种带型的进行讲述：1 染色体带型11 Q 带早就知道
3、，许多荧光染料都能使染色体染上色。6D 年代末期，瑞典著名的细胞光度计专家TCaspersson,在化学家 EdModest 的帮助下成功地合成了芥子哇叮因(明)。并用它在植物和中国仓鼠染色体上进行试验，发现中期染色体经 QM 染色后在荧光显微镜下显示了亮度不同的特征性荧光带。以后他们又把这种技术用于人类染色体，结果是同样地令人满意。根据 Q 带的位置、阔度、亮度，几乎可以精确无误地一一区别每对染色体。在染色体命名国际标准化巴黎会议上(1971)，称这种带为 Q 带。 12 C 带-197。年初 Arrighi 和 Hs。在研究人炎染色体的高度重复 DNA 分布时，偶然观察到着丝点区的以ems
4、a 染色较深，其他区域淡染。深染区的大小对于每一条染色体染色体是值定的，特征性的。也就在同一时候，Mary Lou Fardue 著名的分子细胞学家在以原位分子杂交方法研究小鼠卫星 DNA 分布时，发现经变性和复性处理的小鼠染色体，其若丝点区和骨的其它部分染色不同。这种对结构异染色质特征性染色所显示的带纹被称为 C 带。中期相染色体经适当的酸碱处理后用吉姆萨染色可显示 G 带。此外，老化几年以上的染色体直接用吉姆萨染色也能显示出C 带。13 G 带及高分拼率 G 带在 C 带染色过程中，许多实狡室都观察到，有时染色体的常染色质区会显示.Y 浅不同的带纹。经过各种修改后，形成今夭我们称谓 ASG
5、 染色叩减性处理，盐溶液孵育， Giemsa 染色的分带方法，这种带纹称为 G 带。除了 Q 带外，这是首次可以显示染色体分化的 G 带方法。用各种各样的化学试剂如胶酶、蛋白酶、洗涤剂、尿素、高锰酸钾等等作预处理，然后 Gie,sa 染色，都可得到十分清晰的染色体带纹。其中尤以胶酶消化法重复性好，带纹清晰，反差强，为各室狡室所采用。胶终处理法主要是将染色体制片置 3 7C 0. 25 万胶醉液中进行消化处理，处理时间随片龄(染色体制片保存的日数) 和处理前烤片时间的长短而定。一般片龄长或老化程度高，处理时间就有所增加。或采用将染色体制片经 0. 02F 阿胶醉室沮处理儿秒钟后，再入 2x ss
6、c 溶液中，在 6 0C 沮育 i 小时，结合吉姆萨染色亦能获得清晰的 G 带。 14 R 带在 G 带出现的差不多时间，法国 Dutrliaux( I，71)以 85的磷酸盐溶液处理染色体片子，然后以Giemsa 染色，得到和 ASG 法正好相反的带纹，称之谓 R 带。 Prantara 等人采用 5 微克/毫升的色霉素A2 或橄榄霉素配置在含 2. 5M 抓化镁的研酸级冲液 (D. I5M 叙化钠， 0. 03M 抓化钾和 0. 01M 破酸级钠，调节 PH 至 7. 0 )中处理 20 分钟后，在上述缓冲液中封片。在不同的激光健光镜下产生不同的激发光波而使同一染色体上同时显现出 Q 带粕
7、 R 带图谱。15 N 带N 一带是显示染色体上核仁组织区(nucleolar organizing regions, NORS)的分带方法。Matsui(1974)首先使用该法在蚕豆染色体上显示N 一带，Funaki 等人 (1975)改良)N 一带流程，并在 27 种动、植物染色体上均成功地显示出了 N 一带，此即至今国内外广泛应用的 N 一带技术，其操作流程为:干燥制片在%左右的 1 mol / miNazPoy 水溶掖中处理 10 多分钟 (处理时间因种而异)，水洗 0.5 小时后，用 4% Giemsa 液(pH7.0)染色。 一系列的研究结果表明，在许多双子叶和部分单子叶植物中，该
8、技术对于显示 NORS 具有比较稳定的专一性，但在小麦、大麦、山羊草等禾本科植物中，除 NORS 外，着丝点、端粒和中间异染色质亦能着色，与 C 一带技术所显示的带纹有一定程度的相似性，其原因尚待进一步研究。2 染色体分带技术的应用：染色体分带技术的发展以及原位杂交技术的广泛利用 ,使对这些优质基因在染色体上的进行准确定位成为现实 ,从而可能对这些优质基因在分子水平上进行操作。在此将丛以下几种带型的进行讲述：21 附加系鉴定附加系鉴定是在 Mukai 等(1991)16提出基因组原位杂交技术(GISH) 时开始的。在无特异性探针的情况下 ,用生物素 - 16 - dUTP 标记大麦总 DNA
9、,以小麦总 DNA 作封阻 ,两者按 12 混合与小麦 - 大麦附加系杂交 ,结果小麦 DNA 与小麦染色体杂交呈蓝色 ,而附加的大麦染色体与大麦 DNA 杂交 ,由于有标记而呈棕色 ,从而精确地区分了附加在小麦中的大麦染色体。这种方法不仅不需要克隆化的探针 ,而且可不受细胞分裂周期的限制。用此方法 ,陈佩度、刘大均等用生物素标记的簇毛麦基因组 DNA 作探针 ,以普通小麦染色体组 DNA 作遮盖 ,在有丝分裂中期和减数分裂中期进行杂交 ,经显色检测 ,发现添加到小麦中的簇毛麦 2V 染色体在两端信号较强 ,近着丝点处有较弱的信号 ,其余部分杂交信号较弱 ,强弱分布同染色体 C - 带带型相似
10、。有趣的是 ,Jie Xu 等人24 用 C- 分带技术发现 ,Agrotana (2n = 56)中的 56 条染色体中有 16 条染色体的带型较多 ,象小麦中的 4A 和 1 - 7B 一样 ,而其余染色体带数较少或没有带。用生物素标记的 A2gropyron trichophorum 作探针 ,与 Agrotana 的中期染色体作杂交 ,出乎意料 ,没有看到明显的杂交信号。后改为用小麦基因组作探针与样本杂交 ,发现 Agrotana 中有 40 条信号较明显的染色体是小麦染公体而 14 条无杂交信号的为外源染色体 ,还有一对有部分信号的小麦 - 外源亲本的易位染色体。从而推测 Agrot
11、ana 并不是简单的小麦 Ag. trichorum 的附加系(21+ 7) 而是多品种间经多次杂交得到的后代 ,这也进一步证实了 Schwarzacher 等14用小麦基因组 DNA 作探针检测附加到小麦中的外源染色体的真实性。2. 2 易位系鉴定常用的易位系鉴定方法有粗线期染色体分析法、形态学鉴定法、 - 分带鉴定法。这些只在 C 易位片段较大的情况下才能鉴定出来 ,而对于一些小片段易位 ,则需结合原位杂交技术 ,才能取得令人满意的结果。Lukaszewski 和 Gustafson(1983)用 C - 分带方法鉴定出小麦 - 黑麦的易位系 ,由带纹的变化鉴定出大麦 1RS 染色体易位到
12、小麦 1AL、 上 ,但无法找到易位点 ,易位长度 1BL 也无法估计。黑麦中有一重复 DNA 序列 ,长度约 120bp ,其物种专一性很强。该重复序列散布于整个黑麦基因组。也就是说 ,如果用该重复序列为探针做杂交 ,所有的黑麦染色体将全部被杂交。由于它具有物种专一性 ,因此该探针与小麦染色体几乎不能杂交。由此 Lapitan 等4 把这一 120bp 重复序列克隆到 pSC119 质粒上 ,用生物素标记 ,与小麦 - 黑麦易位系 Amigo 和 Bob white 的染色体杂交 ,通过颜色的明显区别发现 ,在 Amigo 中 ,易位点位于着丝粒处 ,短臂由黑麦 1R 的染色质组成。 Bob
13、white 的易位也涉及着丝粒断裂 ,短臂由 1R 组成。由此可见 ,仅仅采用早期的分带技术已难以完整准确地对易位片段进行细胞学鉴定。Gill5曾认为 ,为了对导入栽培植物的外源片段进行更完整的分子细胞学描述 ,就需要将原位杂交与分带技术结合起来。利用这一技术 ,他们成功地找到了载有小麦条纹花叶病毒抗性基因的易位片段。Friebe6等通过 C- 分带技术鉴定出一小麦 - 中间偃麦草易位系 ,中间偃麦草的 4Ai - 2S 染色体短臂易位到小麦 4DL 上 ,在表形观察基础上 ,发现中间偃麦草的 4Ai - 2S 有抗小麦条纹花叶病毒的作用 ,而且这一染色体短臂对小麦 4DS 染色体臂的丢失有补
14、偿作用。因此得到了小麦抗病育种中一个很有希望的材料。Friebe18结合 C- 分带和原位杂交技术鉴定了辐射诱变的小麦- 中间偃麦草易位系中的易位片段 ,用中间偃麦草基因组 DNA 作探针 ,与中期染色体杂交 ,测量出 4 个主要易位片段的长度 ,获得一个抗叶锈和茎锈的附加系。尔后 ,又发现这些抗锈病基因 Lr38 位于中间偃麦草的 7A 短臂上 ,使 Lr38 基因的定位更具体化19 。2. 3 染色体识别Lane Rayburn 等人(1986)3 在 Gill15对小麦染色体显带基础上 ,采用生物素标记的 pAS1 克隆基因做探针 ,对小麦 D 组染色体作了系统的分子鉴定 ,使 D 组染
15、色体易与 A ,B 组染色体区别开来。次年 ,使用 pSC119 探针作杂交得到同一结论。Lane Rayburn 和 Gill 采用同一技术发现 ,小麦 4A 染色体与其起源 Aegilops Speltoides 和 Aegilops Sharonensis 的 4A 不同 ,而是与 B 组染色体相似 ,因此 ,建议把 4A 染色体划归为 B 组染色体 ,修正了小麦染色体的标准带型。2. 4 基因定位在染色体上定位基因操作主要包括目的基因的标记、细胞染色体杂交以及相应染色体的分带。小麦属中的 5S rRNA 基因的结构与功能前人早已作过研究 ,但它在染色体上的位置却一直难以确定。Mukai
16、(1990)8应用原位杂交技术结合染色体缺失作图的方法 ,对 5S rRNA 在中国春小麦上进行了定位。他通过缺口平移的方法用生物素 - 16 - dUTP 标记 5S rRNA ,与中国春小麦的中期染色体切片做杂交 ,然后用 Giemsa 染色 ,在蓝色染色体上有棕色斑点 ,即 5SrRNA 基因所在位置。Mukai(1990) 采用此方法共定位了 12 个 5S rRNA 基因位点。在大麦上 Apples 于 1980 年通过放射性标记原位杂交法发现 rRNA 基因存在于 6(1) 、(51) 染色体上 ,且信号较强。Leitch7 等把 18S- 5.8S- 26S 这三个 rRNA 基
17、因克隆到 pTa71 质粒上 ,用地高辛 - 11 - dUTP 标记 ,与大麦中期染色体杂交 ,得多个杂交信号 ,而后又用 C- 分带识别各染色体 ,不仅在 6(1) 、(51)染色 7 体上找到了杂交信号 ,而且又发现了另外三个较强的杂交信号 ,分别位于 1(1) 、(1) 、 (1)上且位 75 于短臂 ,制作了大麦的 18s、 8s、5.26s rRNA 的物理图谱。Dong13等把源于小麦基因组文库的一个 2.6Kb 的单/ 寡拷贝的 DNA 序列克隆到 pTsksul26 质粒中 ,用生物素标记后与小麦、大麦染色体杂交 ,结果在小麦、大麦上都发现了杂交信号。这不仅定位了这一基因序列
18、 ,而且对于探讨小麦、大麦的亲缘关系提供了资料。25 银染技术1975 年，Howell 等和 Goodpastuse 等人首先提出显示染色体核仁组织区(NORS)的银染法，后经Hsu 等人 (1975)用分子原位杂交方法证实，确实了银染反应与 rRNA 基因转录活动的平行关系，从而开创了对染色体组中 NOR 进行定性及定量研究的新阶段。近年来，该技术已广泛用于银染核仁、NOR, SC,着丝点等的研究。26 在多倍体起源研究中的应用多倍体现象在植物界中非常普遍，据最新估计(Lewis, 1980s Goldblall, 1980)，在双子叶和单子叶植物中各有 70%为多倍体，在获类植物中多倍体
19、频率高达 97%,染色休多倍化是植物物种进化和形成的重要途径之一多倍体种与其祖先( 或可能祖先) 种的相似程度反映了多倍体形成过程中所发生的遗传分化的剧烈程度.分带技术诞生之后，许多学者应用其从染色体解剖水平上比较多倍体植物与其祖先的相似性，探讨形态分化与遗传分化的关系，成功地解决了一些多倍体植物的起源问题.27 在种下变异和物种分化研究中的应用植物种下变异和物种分化可体现在染色体的不同水平上。染色体倍性、数目和形状等变化虽较易识别，但不能反映染色体结构、成分上的分化.因此，染公体分带技术发明后，许多学者先后运用 C-, N-, Q 一带和银染技术对郁金香属、银莲花属、璋耳细辛属、玉米属、豌豆
20、属、高梁属、大麦属、燕麦属、山羊草属、葱属、延龄草属、重楼属、贝母属和黑麦草属等 130 余属中的各及种下类群进行了带型比较研究。28 在物种地理分布研究中的应用植物适应环境条件的遗传变异，可以体现在染色体带纹上。Barbujani(1989)Z6对虎年万年青属中 Ornithogatum montanum 的意大利各居群中与地理分布样式有关的染色体带型进行了比较分析，发现在 12 条带纹中有 8 条为各居群均有的单态型，另 4 条带纹则与地理分布相关。国内外众多学者在不同种源的栽培植物中发现的 C-,N-, G-, Ag 一带带纹的变异，说明植物适应环境条件而发生的遗传分化，不仅可体现在染色
21、体带纹上，而且这种分化与形态分化是紧密相关的。3 染色体分带意义：染色体分带，原位杂交技术和其它分子技术结合起来，对控制农艺性状的基因进行完美的细胞学遗传分析，从而为克隆这些优质基因，应用十植物遗传育种，培育出更多的对人类有益处的品种打卜坚实的理论应用基础.参考文献：1、 秘庆 动物染色体分带技术 连云港教育学院学报 1995 年第 1 期2、卢一凡 邓继先 刘广田 染色体 C- 分带和原位杂交技术在遗传学上的应用生物技术通报 1998 年 2 期3、赵丽娟 李集临 植物染色体 C - 分带和原位杂交的研究应用 哈尔滨师范大学自然科学学报 第 5 期4、张赞平 候小改 染色体分带技术及其在植物
22、物种生物学中的应用 河南科学 1996 年 6 月3、詹铁生等。玉米根尖细胞染色体 G 一带的诱导。植物学报，19874、朱凤绥等。大麦高分辨染色体显带的初步研究.作物学报，19365、张自立等。黑麦染色体 G 一带的探索，植物学报，19866、陈瑞阳等。植物染色体高分辨 G 一带技术研究，植物学报，1987.一、实验原理 染色体分带是 20 世纪 70 年代发展起来的技术，它借助特殊的处理程序，使染色体显 现出深浅不同的染色带，染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性，可作为鉴别染色体的重要依据，因此无论在遗传学的研究领域，还是在遗传病的诊断、动植物育种 等应用方面，染色体分带都是很有
23、用的技术。 二、实验目的 学习 C 带和 G 带显示方法。 三、实验材料 1 小鼠骨髓细胞染色体标本片。 2 人淋巴细胞染色体标本片。 四、实验器具和药品 1 器具 恒温水箱、显微镜、立式染缸、温度计、镊子、量筒、烧杯、玻棒、漏斗、过滤纸 250ml 试剂瓶、大培养皿、染色玻璃架、载片盒、砂笔。 2 药品及配制 ， (1)pH 6.8PBS ： Na 2 HPO 4 ， 2H 2 O 5.92g ， KH 2 PO 4 4.5g 蒸馏水 1000ml 。 (2)0.2mol L HCI ： 36 -38 浓度的 HCl 6.5ml 加到 983.5ml 蒸馏水中。 (3)5 Ba(OH) 2
24、溶液： Ba(OH) 2 5g 溶于 100ml 蒸馏水中，过滤 ( 用前配 ) 。 (4)2 SSC 溶液： NaCl l 7.54g ，柠檬酸钠 8.82g ，蒸馏水 1000ml 。 (5)pH7.0 ICN 液： NaCl 0.80g ， KCl 0.02g ， Na 2 HPO 4 12H 2 O 0.30g ，蒸馏水 100ml 。 (6)pH7.0 IKN ：葡萄糖 0.10g ， KCl 0.04g ， NaCl 0.80g ， NaHCO 3 0.035g ，蒸馏水 100ml 。 (7)0.25 Trypsin 液： 250mgTrypsin 溶于 100mlICN 液中。
25、 (8)Giemsa 原液。 五、实验步骤 1 C 带技术 (1) 标本片用金钢砂笔编号后，放入 0.2mol L HCI 的染缸中，室温下处理 15min 30min ，目的足使 DNA 脱嘌岭，但 DNA 骨架末断裂。 (2) 自来水冲洗。 (3) 将洗好的标本片放入 5 Ba(OH) 2 的染缸中于 50 水浴处理 10min ，碱处理可能通过产生一个高水平的 DNA 变性，促进 DNA 溶解。 (4) 蒸馏水冲洗。 (5) 在 2 SSC 溶液巾 60 保温 30min ，使 DNA 骨架断裂并使断片溶解。 (6) 蒸馏水冲洗。 (7)1 ： 10Giemsa 染色 10min ， C
26、 带的基本特征是从染色体臂选择性地抽取 DNA ，而 C 带区 DNA 对抽提有较大的抗性，从而保留了一部分 DNA ，因此用 Giemsa 染液巾可显示出 DNA 的不同分布。 (8) 自来水冲洗、干燥。 (9) 镜检：低倍镜下找到分散好的细胞中期分裂相，换油镜仔细观察 C 带特点，如着丝粒区域或异染色质部位、次缢痕及 Y 染色体深染、染色体其它部位浅染，即为可取标本。 2 G 带技术 (1) 标本片置 60 烘箱中 16h24h 。 (2) 取烘过的标本置预热到 37 的 0 25 Trypsin 液中 0.5min lmin( 处理时间随气温和片冷而异 ) ，近年来的研究表明，用 Try
27、psin 处理染色体标本是 G 带显示的一种预处理方式，它可以从染色体上抽取蛋白质的特定组成部分。 Giemsa 是噻嗪曙红染料，染色首先取决于二个分子同 DNA 结合，在此基础上它们结合一个曙红分子，其次取决于有助于染料沉淀物累积的疏水环境，通过 Trypsin 预处理可以使阴性 G 带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变为更疏水状态。由此可见在 G 带中抽取蛋白往往是疏水的，而且主要来自阴性 G 带区 (3) 用 pH6.8PBS 配制的 5 Giemsa 液染色 10min20min 。 (4) 蒸馏水漂洗数次，空气干燥。 (5) 镜检：低倍镜下找到分散好的细胞中期分裂相，换油镜仔细观察 G 带，染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本。 六、注意事项 1 在 C 带技术中，若观察到染色体均呈白色，可能是碱处理或 2 SSC 温育过度了。 2 在 G 带技术中，若观察到染色体变粗、边缘发毛，有时甚至成糊状，那可能是处理过度了 七、作业 1 交 C 带、 G 带标本各一张 2 思考 C 带技术和 G 带技术原理的异同。
