1、蛋白质浓度的测定一紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在 280 nm 附近。某些蛋白质含有二硫键，也会在 280 nm 附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在 280 nm 处的吸光度 A280 也存在非常大的差异。比如，当蛋白质浓度为 1 mg/ml 时，吸光度 A280 可为 0-4 之间的任何值。但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时 0.5-1.5 之间的某个 值。该方法测定蛋
2、白质的浓度具有明显的优缺点。这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对 buffer 没有特殊要求， 这是该方法的优点。该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A (absorbance) = c l，因此：c （mg/ml）= A/ l (cm)。消光系数：当蛋白质浓度为 1 mg/ml，光径 为 1 cm 时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。蛋白质的消光系数计算公式：A 280 (1 mg/mL)
3、= (5690nw + 1280ny + 120nc)/M。其中M 为蛋白质分子质量，5690、1280 与 120 分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n 是该氨基酸残基的数目。2. 远紫外吸收光谱法在 190-210 nm 范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长范围内，肽键在 190 nm 处的吸收值是其在 205 nm 的 2 倍，而且在 190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取 205 nm 处的吸收值对蛋白质进行定量。对于 1 mg/ml 的蛋白质溶液，它 们的消光系数通常在 30-35 之间。对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。该方法的优点是
4、操作简单，灵敏度高，样品可以回收。缺点：在使用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种 buffer，heme or pyridoxal groups 在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。测定：1. 用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在 215 nm 处的吸收值小于 1.5。2. 磷酸钾 buffer 不影响吸收值的测定。3. 计算公式：A 2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205) 或 Protein concentration (g/mL) = 144 (A215 A225)。Notes:1. 使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值范围为 0.05-1，当吸收值为
5、 0.3 时，测定的结果最精确。2. 如果样品浑浊，可以扣除 310 nm 处的吸收值。3. 当蛋白质浓度很低时，蛋白质可能会吸附在石英杯内壁，从而影响蛋白质浓度的测定，在溶液中提高离子强度或者添加非离子型去垢剂可以防止这种现象的发生。4. 1 mg/ml 的 BSA 的吸收值为 0.06，通常作 为蛋白标准品。5. 当溶液中存在核酸时，可以用下列公式计算蛋白质浓度：Protein (mg/mL) = (A235 A280)/2.51Protein (mg/mL) = (A235 A280)/2.51Protein (mg/mL) = 0.183 A230 0.0758 A2606. 当吸收值
6、小于 2 时，在 215 nm 处测定的吸收值 符合朗伯比尔定律。7. 在 215 nm 处进行测定时，sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate, and Tris 不会影响吸收值的测定，但是 0.1 M acetate, succinate, citrate, phthalate, and barbiturate 具有很强的吸收值。8. 在 pH 4-8 的范围内， 215225 nm 的吸收值没有变化。9. 当蛋白质中存在核酸时，也可以这样计算：protein concentration (in mg/ml) =F A280
7、(assuming the cuvette is 1 cm wide).二Lowry 法与 BCA 法Lowry 法与 BCA 法测定蛋白的浓度的原理包括两个步 骤。第一步，基于双缩脲反应。在碱性溶液中， 肽键中的 N 原子结合二价铜离子，将Cu2+还原成 Cu+，并形成一种铜离子络合物，反应后的溶液呈紫色，溶液在 540 nm 处有明显的吸收峰，根据朗伯比 尔定律，可以测定蛋白质的浓度。双缩脲反应但是，直接测定肽键与铜离子络合物的吸收值灵敏度低，所以通常继续进行第二步反应增加灵敏度。在 Lowry 法中，Cu +在第二步反 应中会与 Folin酚试剂反应。该试剂是一种钼磷酸盐与磷钨酸盐的混合
8、物。反应的本质是 Mo6+还原成钼蓝（Mo4+），此反应依赖于 Cu+催化的芳香族氨基酸（酪氨酸与色氨酸）的氧化。因此，与近紫外吸收光谱法一样，Lowry 法测定的蛋白质浓度也只是一个近似值，不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸数目的差异会导致所测浓度值存在误差。实验材料：1. 络合物生成试剂：在实验开始前，以 100:1:1 的体积比混合下列溶液。溶液 A：2% (w/v) Na2CO3;溶液 B：1% (w/v) CuSO45H2O;溶液 C：2% (w/v)酒石酸钾。2. 2 M NaOH。3. Folin 试剂 。使用 时为 1 当量浓度（N）。4. 标准：将 2 mg/ml 的 BSA
9、 按照下表进行稀释。方法：1. 取 0.1 ml 样品溶液或者标准溶液，加入 0.1 ml 1 M 氢氧化钠，在 100水解反应 10 分钟。2. 冷却水解产物至室温，加入 1 ml 新鲜混合的络合物生成试剂，混匀后室温静置 10 分钟。3. 加入 0.1 ml Folin 酚试剂，迅速震 荡混匀，室温静置 30-60 分钟，不要超 过 60分钟。4. 当蛋白浓度小于 0.5 mg/ml 时，读取 750 nm 处吸收值。当蛋白浓度 0.1-2.0 mg/ml 时，读取 550 nm 处吸收值。5. 绘制标准溶液浓度曲线，根据比对此曲线吸收值对应的浓度，确定位置蛋白质的浓度。Notes:1.
10、当蛋白质样品以沉淀存在时，用 2 M 氢氧化钠溶液溶解样品，然后按照步骤一进行水解。然后取 0.2 ml 水解产物进入步骤二。2. 全细胞或复合物样品需要预处理。处理方法见 The Protein Protocols Handbook, second edition, Page 29.3. 确保水解反应在 pH 10-10.5。4. 反应孵育时间可以从 10 分钟到几个小时，影响不大。5. 涡旋振荡步骤是该方法可重复的关键。因为 Folin 酚试剂很容易失效，因此加入后要迅速充分的震荡混匀。6. 高浓度时标准溶液曲线可能不是线性的，因此最佳测定范围：0.01-1 mg/ml。7. 因为不同的蛋
11、白质所含有的色氨酸与酪氨酸的数目不同，为了浓度的准确性，可以采用多种标准蛋白质溶液绘制曲线，求得多个浓度值，最后取平均浓度值。8. Buffer，药物， 还原糖，核酸等物质都会干扰蛋白质浓度的测定。9. 分两次加入 Folin 酚试剂 ，每次加入后充分混匀，可以提高 20%的灵敏度。加入 Folin 酚试剂 后 3 分钟时 加入二硫苏糖醇，可以将反应灵敏度提高 50%。10. 升高温度可以加快反应的进行，对反应结果影响不大。与 Lowry 法一致，BCA 法基于二价 铜离子还原成一价铜离子的反应测定蛋白质的浓度。第二步，每两分子的 BCA 螯合一分子一价铜离子，形成在 562 nm 具有强吸收
12、峰的紫色复合物。此反应依赖于半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸与色氨酸 侧链，高温下肽键可以参与铜离子的还原，因此高温反应可以降低不同蛋白质之间因氨基酸组成差异而造成的结果差异。与 Folin 试剂相比较，BCA 在碱性条件下很稳定，也没有那么容易受到其他物质的干扰，因此， BCA 法目前基本上取代了Lowry 法。实验材料标准实验：试剂 A：sodium bicinchoninate (0.1 g), Na2CO3 H2O (2.0 g), sodium tartrate (dihydrate) (0.16 g), NaOH (0.4 g), NaHCO3 (0.95 g), made up to 1
13、00 mL. If necessary, adjust the pH to 11.25 with NaHCO3 or NaOH。试剂 B：Reagent B: CuSO4 5H2O (0.4 g) in 10 mL of waterStandard working reagent (SWR): 混合 100 体积 regent A 与 2 体积 reagent B. 溶液呈苹果绿色，室温下可以稳定保存 1 周。微量测定：Reagent A: Na2CO3 H2O (0.8 g), NaOH (1.6 g), sodium tartrate (dihydrate) (1.6 g), made u
14、p to 100 mL with water, and adjusted to pH 11.25 with 10 M NaOH.Reagent B: BCA (4.0 g) in 100 mL of water.Reagent C: CuSO4 5H2O (0.4 g) in 10 mL of water.Standard working reagent (SWR): Mix 1 vol of reagent C with 25 vol of reagent B, then add 26 vol of reagent A.方法：见 The Protein Protocols Handbook, Page 31。Notes:1. 试剂 A 与 B 非常稳定，可以购买。2. 延长样品孵育时间可以增强灵敏度。注意要保持标准品孵育时间与样品孵育时间一致。3. 加热后，溶液颜色在 1 小时内都是非常稳定的。4. 样品中含有干扰物质时，可以将样品结合到尼龙膜上，然后洗掉杂质， BCA可以与膜上的蛋白质反应。
