1、1BCA 法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1. BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500 次酶标仪，碧云天），含以下成分：a) BCA 试剂 A（P0012-1 ，100ml，碧云天），室温保存b) BCA 试剂 B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存c) 蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20 度保存二、仪器和试剂1. 酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅2. 96孔单条可拆酶标板（平底）3. 15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用） 4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）5. 单道移液器和枪
2、头，8道移液器（排枪）和枪头6. PBS三、操作步骤1. 水浴锅调至 37。2. 蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20 冰箱中取出，完全溶解并混匀。取60l 蛋白标准品（5mg/ml），加入240l PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。3. 计算BCA工作液总量= 0.2 ml（ 样本数+8）21.1（标准品和样本均需测复孔） 。BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。样本数(n) 15 67 810 1112 1314 1516 1719 2
3、021 2223 2426A（ml ） 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15B（ml ） 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.24 0.26 0.28 0.3总量(ml) 6.12 7.14 8.16 9.18 10.2 11.22 12.24 13.26 14.28 15.34. 按下表配制 8 个蛋白标准液（S0S7） ，充分摇匀。单条酶标板蛋白标准品工作液（1 mg/ml ）( l)PBS(l)蛋白标准品终浓度(mg/ml)A S0 0 100 0B S1 5 95 0.05C S2 10 90 0.1D S3 20 80 0.2E S4 30 7
4、0 0.3F S5 40 60 0.4G S6 50 50 0.5H S7 100 0 1.025. 将 96 孔酶标板的 A1 孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。（1） 先在第 34 条酶标板的蛋白样本孔（N 1N8）中加入 待测蛋白样本各 2l，再用排枪在蛋白样本孔中追加 PBS 液各 18l，使总量达到 20l。（此时蛋白样本的稀释比为 10，适用于预计蛋白浓度为 28mg/ml 时。如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）（2） 再在第 12 条酶标板的蛋白标准品孔（S0S7）中加入上面配制的 8 个蛋白标准液各 20l。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1
5、2A S0 S0 N1 N1B S1 S1 N2 N2C S2 S2 N3 N3D S3 S3 N4 N4E S4 S4 N5 N5F S5 S5 N6 N6G S6 S6 N7 N7H S7 S7 N8 N86. 用排枪在各孔中加入200l BCA 工作液，轻轻摇匀，37放置30分钟或室温放置2小时。（注意：每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。如果浓度较低，可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）7. 用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。8. 用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562 为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算公式Y=A X + B。根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数） 。9. 按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml ，分装为每支100l。
