1、1一验证方案起草说明高效液相色谱是当今应用最为普遍的分析技术，HPLC 系统通过可重现的溶剂输送、进样、高灵敏度检测及工作站的数据分析，可得到优异的定性和定量分析结果。为此，本化验室采用高效液相色谱法，对产品进行纯度检测、分析。整个检测过程从溶剂输送、检测到结果分析，全部由电脑控制，自动完成，溶剂脱气采用超声波脱气、进样由手动进样器完成。二验证方案简述高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。我们根据高效液相仪的使用要求
2、,参考 HP 之 OQ/PV 以及实际需要对仪器以下关键参数进行测试，以确认 HP1100 系列高效液相色谱仪是符合设计要求的：1. 波长准确度测试 2氧化钬测试3.检测器线性测试 4杂讯测试 5.柱温箱温度准确性测试6.流量准确性测试7.手动进样器精确度与交叉污染测试三验证报告的编写和批准签名1验证小组成员四验证目的：确认 HP1100 高效液相色谱仪符合设计要求，能为中间产品检测提供准确的分析数据。五验证范围：1通过波长准确度测试,氧化钬测试，确认 UV 检测器的波长准确度。2. 通过检测器线性测试，确认检测器在操作吸收度范围内（最大到 2AU）有线性应答关系。3. 通过杂讯测试，确认检测
3、器及单元泵系统之系统杂讯操作在可接受的规范。4. 通过柱温箱温度准确性测试, 确认柱温箱的温度在合格规范内是准确的.5. 通过流量准确性测试/精确度测试，确认泵系统所输送的溶剂体积在可接受规范值内，2且无大的流量误差。6通过进样器精确度与交叉污染测试，确认手动进样器的精确度在可接受的标准范围内，各次注射间样品的交叉污染（前次注射所造成的样品污染）在可接受范围之内。六名词解释RSD% 相对标准偏差，本方案中主要是计算标准 A 前 5 针的相对标准偏差。RSD%2.0%。D% 相对偏差的绝对值,本方案中 D 是标准 A5 针校正因子的平均值 A 与标准 B3 针校正 因子平均值 B 的相对偏差的绝
4、对值，D%2.0%。检测限（LOD）试样中被测物能被检测的最低量，以信噪比为 2：1 时，相应浓度确定检测限。定量限（LOQ）试样中被测和能被定量测定的最低量，以信噪比为 10：1 时，相应浓度确定量限。W/W 用已确定的检测限或定量限与样品检测时的浓度（250.0mg/ul）比较，得到的比值。分离度 R 谱图中相邻两峰的分离度。七.相关文件文件名称 存放位置 八验证具体步骤81验证用仪器、设备的校正HP1100 高效液相色 谱仪，包括：单元泵： 手动进样器： 柱温箱: VWD 多波长检测器：8.1.1 仪器情况仪器名称 仪器型号 仪器厂家 仪器编号 仪器精密度高效液相色谱仪 HP11003水
5、银温度计 0-1001/万电子天平 AEG-120G填表人/日期：8.1.2 验证用仪器校正情况和结果仪器名称 校正日期 校正结果 校正有效日期 校验单位高效液相色谱仪水银温度计1/万电子天平填表人/日期：8.2 验证用试剂的准备试 剂 名 称 来 源100% 纯水 水处理室咖啡因 Caffeine 标准品组 美国惠普部门： 填表人/日期：83 验证步骤8.31 验证的准备工作（1） 将限流毛细管（HP 物料编号 5022-2159 ）安装到装色谱柱位置。（2） 开始 OQ/PV 程序前 24 小时打开检测器灯管，达到最佳的检测器稳定性的状态。（3） 将管道 A 注入纯水。（4） 打开分析管柱
6、温控箱的开关，将两个热交换器的温度设定在 40。（5） 把温度表探头安装在柱温箱的热交换器上。（6） 打开清洗阀，以 5ml/min 流速将 A 管道至少清洗 10 分钟以上。（7） 关闭泵与清洗阀。（8） 调节流量 1.0ml/min 的纯水（100%）通过检验器，继续其他安装程序待系统达到平衡。（9） 将 OQ/PV 咖啡因标准品依照表 1 的位置装到手动进样器旁边。832 波长准确度测试原理4波长的准确度可利用测定一已知其光谱的化合物来加以得知。在特定的波长下，光谱内某一特定波段一定会出现，此一波段与特定波长的偏差则可视为检测器的不确度。本测试所用的标准品为浓度 25ug/ml 的咖啡因
7、溶液。咖啡因在 272 nm 波长时有最大吸收，而在244 nm 有最小吸收，这两个波长即用以验证 UV 检测器的波长准确度。可变波长检测器（VWD）：先在水流过检测器、流动池时作一空白扫描，然后以自动进样方式将咖啡因注入流动池中。作波长扫描，空白光谱会自动扣除。设备HP1100 系列的单元泵，手动进样器，配有温度控制之可变波长检测器。测试条件方法：HP OQ/PV 之波长准确性测试. 流动相 A：纯水。流量 1.0 ml/min。. 柱温箱温度：40。. 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 标准品#3（25ug/ml）咖啡因，用注射器按编号注射到手动进样器里。. 运行方法，其结果自动记
8、录并显示测试结果。测试评估所测得最大/最小波长与预期的最大/最小波长之间的偏差会自动计算，测得结果列入OQ/PV 报告中。认可标准及结果名称 最大波长 1 最大波长 2 最小波长最大偏差标准 2.0nm 2.0nm 2.0nm测定值测得最大偏差5结论签名/日期： 复核/日期：8. 3. 3 Holmium Oxide 氧 化 钬 测 试(检 测 器)原理检测器波长校正准确度可以借助测量一已知化合物的光谱来加以求取，在特定波长下，光谱应该显示特定的波段，此一波段与给定波长间的差值，即可视为检测器的不准确度，内建具有最大特性吸收的氧化钬滤光器则可用于决定波长准确度。可变波长检测器（VWD）：VWD
9、 利用下列氧化钬的三个最大波长来测定波长准确度：. 360.8nm. 418.5nm. 536.4nm氧化钬测试会进行内建氧化钬滤光器的扫描,求取最大吸收波长与期望波长之差值, 为了避免吸收溶剂的效应，此一测试是在流动池充满水的情况下进行。设备HP1100 系列的单元泵，手动进样器，配置 Chemstation 控制的可变波长 VWD 检测器认可标准波长准确性2.0nm测试条件方法：HP OQ/PV 之氧化钬测试. 纯水置于管线 A 中. 100% A，流量 1ml/min. 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 柱温箱之温度：40。测试评估准确度可由最大吸收时的测量波长与理论波长的偏差来
10、检定。在特定波长范围内, 测出最小及最大光源强度，并自动与合格规范值作比较，结果将列验证报告中。认可标准及结果要求值 (nm) 标准差值 测定值(nm) 测得差值 结 论63608 2.0nm4185 2.0nm5364 2.0nm签名/日期： 复核/日期： 8. 3. 4 检测器响应线性测试原理当光吸收的量超过某一限度时，吸收检测器即呈现非线性现象。造成非线性现象主要原因是散光，在较高的吸收时，散光变得重要，对检测器的应答影响就愈重要。线性的测试方法是在不同样品瓶中放入不同浓度的咖啡因标准品（依序增加浓度） ，每一样品瓶注入多次，每次注入相同体积，色谱图应该得到面积愈来愈大的波峰，当这些波峰
11、的面积（或高度）对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。设备HP1100 系列的单元泵，手动进样器，配有温度控制的可变波长检测器。测试条件方法：HP OQ/PV 之检测器线性测试顺序：。进样量：20ul管线 A：HPLC 级纯水流量 1.0ml/min 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。标准品#1，#2，#3，#4，#5 依序放在手动进样器旁边 1、2、3、4、5 的位置上。. 检测波长：273nm测试评估将所得波峰面积（或高度）对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线，实际上就是强迫通过原点，线性回归的一条校正曲线，此一校正曲线的相关性（相关系数）即可作为测量检测器的
12、一种判断依据。此直线斜率的倒数即是列印在校正表格中的应答因子。理论上每个浓度下的应答因子应是相同的。因此针对这些应答因子所得的相对标准差即可作为测试检测器线性的另一判断依据。认可标准及结果7相关性标准0.999 位置样品名 针数 样品浓度/峰面积 标准浓度 结 论1 咖啡因 1 1 0.5ug/ml 2 咖啡因 2 1 1.0ug/ml3 咖啡因 3 1 5ug/ml4 咖啡因 4 1 25ug/ml5 咖啡因 5 1 50ug/ml签名/日期： 复核/日期：以峰面积与浓度可作出图如下： 样品名称：咖啡因Area 检测波长：273nm相关性： 公式：Y=mx+bm: b:x:Amount(ng
13、/ul)Y:AreaAmount(ng/ul)835 杂讯、温度稳定性测试（检测器、柱温箱）A 杂讯测试原理杂讯，偏移及偏离是检测器的特定性能。在分析极微量化合物时，检测器的杂讯低与否就显得特别重要，偏移及偏离值对积分的品质影响最大。紫外线/可见光（UV/Vis）吸收检测器的杂讯是采用 ASTM（ASTME19.09）方法来测试，ASTM 杂讯测试是根据美国国家标准协会对测定液相色谱仪所用可变波长检测为之标准程序。为尽可能测得实际的杂讯，选用水作测试溶剂（因为大多溶剂组合中都会用到水） ，所选用的波长也是落在常用的波长范围内。偏移基本上是温度所造成的，其主要的影响是在灯管热机时（约 1 小时）
14、 ，在进行 ASTM 杂讯测试时，为避免温度（偏移）的效应，必须至少在 24 小时前打开灯管。B 度稳定性测试8原理为测试温度稳定性，在杂讯测试时即可使用一内部温度感测器将温度不断记录下来。理论上，在测试过程中，温度讯号应该保持稳定，最大温度与最小温度的差距即可视为温度讯号的稳定性。设备HP1100 系列单元泵，手动进样器，配置有 Chemstation 控制的 VWD 检测器。测试条件方法：HP OQ/PVHPLC 级纯水置于管线 A 中. 100% A，流量 1ml/min，运行时间：20 分钟. 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。测试评估首先，将讯号以每一分钟为
15、区隔切割成 20 等份，每一等份的偏移可由回归线的线性斜率求得。其次，各时间等份平行线的波峰到波峰杂讯（垂直距离）可视为经偏移校正过的波峰到波峰杂讯，所有波峰对波峰杂讯的平均值即为杂讯值。偏移值是指 20 个时间等份内平行线斜率的平均值。偏离值的求取是将 20 个时间等份的中点连起来，将杂讯计算方式应用于此线即可求得。所得的基准线杂讯、偏移及偏离值、设定温度的最大偏差值与可接受的标准相比较，自动与 OQ/PV 系统建立时所定义的合格规范值相比较，测试值会列入 OQ/PV 报告中。认可标准及结果测 试 项 目 接受标准（限制） 测 试 结 果 结 论杂讯, 温度准确性ASTM 杂讯mAU 0.4
16、0偏移mAU 0.2漂移mAU/h 0.5温度稳定性左 0.5温度稳定性右 0.59签名/日期： 复核/日期：杂讯测试结果时 间 杂讯 杂讯 杂讯 漂离 漂移 温度稳定性由(分) 至（分） (6*SD)mAU (Ptop) (ASTM) (mAU) mAU/h 左 右签名/日期： 复核/日期： 8. 3. 6 柱温箱温度准确性测试（柱温箱） 原理温度的准确度是借助一已事先校正过的外来温度计来检测，此留点温度计附在柱温箱热交换器的测量点上，待系统平衡后，便读取温度计的温度，将此温度与柱温箱设定温度相比较，并检测两者之差距是否在合格范围内。此测试取 25，27，40，60，65五个温度点。设备HP
17、1100 系列单元泵，手动进样器，配置有 Chemstation 控制的 VWD 检测器。测试条件方法：HP OQ/PV. 纯水置于管线 A 中. 100% A，流量 1.0 ml/min. 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。测试评估评估包括将外部温度计所量的温度与柱温箱的设定温度相减，比较差值是否在合格规范值内。认可标准及结果标准偏差 测得温度 差值设定温度左 右 左 右 左 右结论2530104050556065签名/日期： 复核/日期：837 流量准确度/精确度测试（泵）原理流量被定义为一定时间内被送出的体积量；在 HP1100 系列的泵系统中，流量则被定义为活
18、塞推送的速度。确认流速的方法是将检测器的出口端直接注入一已知重量的容量瓶，通过测量单位时间内容量瓶重量的变化而折算出溶液的体积量。设备HP1100 系列单元泵，手动进样器，配置有 Chemstation 控制的 VWD 检测器。秒表：NO：0011322 100ml（校正的）容量瓶测试条件方法：按设定的运行时间，检测器波长 254nm顺序：流量 0.5ml/min、1.0ml/min、2.0ml/min、3.0ml/min . 纯水置于管线 A 中 . 流量 1.0ml/min. 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. . 柱温箱温度：40。测试评估将在不同时间内检测器出口收集到的溶剂量-一
19、体积可用以计算流量准确度，测量的流量与其设定值比较。认可标准及结果认可标准 准确性5.0% 精确度 RSD%0.5%流量准确性测试结果-1流量： 0.500ml/分钟 压力：29.7bar序号容量瓶重（g）时间(s)瓶重+水重（g）水重(g）温度(）密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)1112345678910平均流量（ml/min）： RSD%签名/日期: 复核/日期:流量准确性测试结果-2流量：1.000ml/分钟 压力：59.8bar序号容量瓶重（g）时间(s)瓶重+水重（g）水重(g）温度(）密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均
20、流量（ml/min）： RSD%签名/日期: 复核/日期:流量准确性测试结果-3流量： 2.000ml/分钟 压力： 118.5bar序号容量瓶重（g）时间(s)瓶重+水重（g）水重(g）温度(）密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)1122345678910平均流量（ml/min）： RSD%签名/日期: 复核/日期:流量准确性测试结果-4流量： 3.00ml/分钟 压力： 179.1bar序号容量瓶重（g）时间(s)瓶重+水重（g）水重(g）温度(）密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均流量（ml/min）： RSD%签名/日期: 复核
21、/日期:838 进样器精确度与交叉污染测试（手动进样器）A 进样器精确度原理进样器精确度的测试是利用注入多次相同体积咖啡因标准品的方法进行。在相同注入体积下，色谱图应该显示相同面积的波峰，这些面积和平均面积的偏差应该愈小愈好，此13偏差通常以面积标准差来表示，标准差与平均面积之比可得相对标准差。相对标准差即可用以作为精确度的测量，此数值最后再与可接受的标准范围比较。B 交叉污染测试原理为测试样品交叉污染的情况，首先注入一高浓度的样品，将充满于另一样品瓶中的溶剂注入（溶剂与前次高浓度溶液相同） 。在理想的情形下，第二次注射分析结果不应有样品出现，而第二次注射所出现的样品面积即可作为交叉污染的测定
22、值指标。设备HP1100 系列单元泵，手动进样器，配置有 Chemstation 控制的 VWD 检测器。测试条件方法：HP OQ/PV 之进样器精确度与交叉污染测试顺序位置 样品名 针数 浓 度 进样量 图谱编号6 空白 3 0.00 20ul OQPVINUPRC 014 咖啡因 4 6 25ug/ml 20ul OQPVINUPRC 046 空白 1 0.00 20ul OQPVINUPRC 10。 检测波长 273nm. 管线 A：纯水. 流量 1.0ml/min . 限流毛细管 2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。. 标准品#4(25ug/ml 咖啡因)，放在手动进样器旁
23、边位置 4。. HPLC 级纯水（空白瓶） ，放在手动进样器旁边位置 6。测试评估每一个咖啡因波峰的面积、高度及停滞时间得到后，计算每一个波峰对平均值的相对标准差（RSD%） 。认可标准及结果进样器精确度与交叉污染认可标准14测 试 项 目 接受标准（限制） 测 试 结 果 结 论进样器精确度与交叉污染精确度 面积 （RSD %）1.000精确度 高度 （RSD %）2.0交叉污染 面积 （RSD %）0.2交叉污染 高度 （RSD %）0.4签名/日期： 复核/日期：进样器交叉污染测试结果名 称 前次运行 当次运行 交叉污染（%）峰面积峰高签名/日期： 复核/日期： 进样器精确度测试结果运行
24、序号 保留时间（min） 峰高（mAU） 峰面积（mAU）*S)456789平均：SDRSD95% CI签名/日期： 复核/日期：15九、验证结果及结论91验证标准及结果测 试 项 目 接受标准（限制） 测 试 结 果 结 论1VWD 波长准确性最大波长 1 准确度nm 2.0最大波长 2 准确度nm 2.0最小波长准确度nm 2.02.氧化钬波长波长准确性nm 2.03.温度准确性左侧温度准确性边 2.0右侧温度准确性 2.04.检测器线性相关性 0.999005. 杂讯, 温度准确性ASTM 杂讯mAU 0.040偏移mAU 0.2漂移mAU/h 0.5温度稳定性左 0.5温度稳定性右 0
25、.56.流量准确性/精确性准确性（%） 5.0精确性（%） 0.507.进样器精确度与交叉污染精确度 面积 （RSD %） 1.000精确度 高度 （RSD %） 2.0交叉污染 面积 （RSD %） 0.2交叉污染 高度 （RSD %） 0.4填表人/日期：92结论 16附录：分析所用方程式回归分析杂讯测试及测试线性时均使用回归分析进行评估，通常回归分析的方程式表示如下，线性则由线性方程式得来：线性方程式：Y（X）=a+b*X其中 N=观察值数目Xi=自变数，第 i 个观察值Yi=因变数，第 i 个观察值方程式 1 系数计算其中方程式 2 相对标准差（RSD）的计算标准差：相对标准差：21
26、2NbXaYSDNi iiYR0Yni1Ni iNiiNii YXXa1112*(YXNi Niiiir*)(11122 NiiNiiNiiXb111(其中 回归系数其中17杂讯测试方程式 3 以线性回归分析求取每个值的偏移其中：Y（X） = 讯号之应答X = 讯号时间a = 斜率，与偏移相等b = 偏称线之截距方程式 4 波峰到波峰杂讯及偏离的求取NptoP=(RspMaxi-Yi)-(RspMinj-Yj )其中 Nptop = 波峰到波峰的杂讯PspMaxi =相对偏移有最大正垂直距离波峰 i 的应答RspMini =相对偏移有小最负垂直距离波峰 i 的应答y i=波峰 i, 其偏移线的相对应应答yj =波峰 j ,其偏移线的相对应应答方程式 5 ASTM 杂讯（N ASTM）的计算其中 NPtopi =第 i 行循环之波峰到波峰杂讯n=总循环之总数检测器线性测试检测器线性是借助前面所提线性回归分析的相对标准差来表示。与 SD 相等其中 i=第 i 个咖啡因波峰之面积，高度中停滞时间。Aav n 个实验咖啡因波峰之面积、高度或停滞时间的平均值。baXniptoiastm1nAavni112nAniavi标 准 差
