1、肝脏谷丙转氨酶活力测定,进入实验室要注意的问题,安全第一，在实验室中使用挥发性试剂时应在通风橱中进行，以免发生中毒事件；不得在实验室中随意使用明火，因为实验室中有许多易燃易爆药品，使用明火可能引起火灾或引发爆炸事件；不得在实验室吃东西，实验结束后也应将手洗净再吃东西 。,在实验室中不得嬉戏打闹，更不得用实验药品互相开玩笑。实验中使用药品应尽量节约，不得浪费药品，未使用完的药品因倒人废液缸或指定的容器中，切不可倒入原试剂瓶以免污染试剂。实验完成之前不能离开实验室，如有特殊原因要离开需经实验室负责人批准才能离开。每个实验台内的各种仪器的摆放顺序要牢记，离开实验室前要将仪器按顺序摆放好。养成一个好的
2、习惯。,实验目的,了解转氨酶的性质及临床意义，并掌握谷丙转氨酶活力的测定方法,实验原理,在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基为大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。,丙氨酸,丙酮酸,a-酮戊二酸,谷氨酸,脱去氨基,联合脱氨基作用,谷丙转氨酶,本实验以丙氨酸和-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。,-酮戊二酸与能与2，4
3、二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和-酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。,实验器材,容量瓶100ml 4个 500ml 2个；电子天平；玻璃棒；研钵；试管 5支；试管架；移液管 0.5ml 2支；1ml 2支；5ml 1支；滴管1支；分光光度计，比色皿4个；,实验试剂,1、标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05mol/L H2SO4中，现用现
4、配。2、谷丙转氨酶底物：称取0.90g L-丙氨酸，29.2mg -酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1mol/L 的磷酸缓冲液中。然后用1 mol/L NaOH 调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的磷酸缓冲液定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。3、0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液 ：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。,4、0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2,4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。加热溶解，用1mol/L HCl定容到100ml。（后经试验发现取20mg 2,4 -
5、二硝基苯肼，溶于7ml11.6mol/L的浓盐酸，再定容至100ml效果更好）5、0.4mol/L NaOH ：称取16g NaOH定容到1000ml。6、0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。,换,操作,1.肝匀浆的制备（1）将小白鼠处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷的pH7.4的磷酸缓冲液 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 保存在冰水中备用。,（2）吸取上述肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液 4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆。,2.谷丙转氨酶活力的测定 （1）取4支试管，分别注
6、明“测定管”、“对照管”、“标准管”、“空白管”。（具体操作见下表）,加样顺序,（2）混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，读取测定管与对照管的吸光度，将测定管的吸光度减去标准管的吸光度后与标准管进行比较算出相当于丙酮酸的含量。,分光光度计,操作注意事项,比色皿（拿法，装液，润洗）光度计（预热，疲劳保护，吸收波长）卫生（培养皿，擦镜纸，废液缸）吸光度测定注意调零。,计算,谷丙转氨酶活力计算： 本法规定酶在37与底物30min后能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位。据此计算每毫升稀释肝匀浆的谷丙转氨酶活力单位及每克肝组织中的谷丙转氨酶的总活力单位,（1）每毫升肝匀浆谷
7、丙转氨酶活力单位的计算：D=(A-B) 500/（S2.5）=(A-B) 200/S式中D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)；A:样品管吸光度值；B:对照管吸光度值；S:标准管吸光度值 ；500:标准丙酮酸溶液 ；2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数,（2）每克肝组织中的谷丙转氨酶的总活力单位D=D5010/0.5式中D： 每克肝组织中的谷丙转氨酶单位（U/g）；D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)；50:稀释倍数；10：0.5g肝脏制成10%肝匀浆；0.5：0.5g肝脏,思考题：1、为什么在研磨肝脏的过程当中，必须在冰水浴中进行？2、为什么加入底物和肝匀浆后要准确保温30分钟？3、为什么加入2.4-二硝基苯肼溶液后一定要保温？,预祝大家实验成功！,
