1、242 生TT物技 术 通 讯v。125 N2Mar,LEERS IN BIOTECHNOLOGY 2,3 o a 2叭4TT ol l、上 上uIdoi：103969巧issn10090002201402021Ames试验假阳性的判断方法陈颖，姜娟，杨阳，李莹，周莉，孙祖越上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，中国生育调节药物毒理学检测中心，上海200032技术方法摘要 目的：确立一种判断Ames试验假阳性的可靠方法。方法：在Ames平皿掺入试验中发现经受试物处理的TA97和TAl535的菌落数相比溶媒对照组明显增加，为了证实其是因为受试物致突变性导致的回变菌落数增加还是由受试物毒性导致
2、的菌落数增加，对分别经受试物和阳性对照物处理的Ames菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上，观察比较细菌的生长情况：结果：经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中，而经阳性对照物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上，说明经受试物处理的菌株没有发生突变。结论：此方法能可靠地验证菌株是否为突变菌株，由本研究可以发现经受试物处理的菌株没有发生突变，Ames平皿掺入试验中所观察到的菌落数增加是由于受试物毒性造成的假阳性。关键词 Ames试验；假阳性；判断方法中图分类号R9653 文献标识码A 文章编号 1009-0002(2014)020242一03A Judgment Method
3、of the False Positive Result in Ames TestCHEN Ying，JIANG Juan，YANG Yang,LI Ying，ZHOU Li，SUN ZuYue4Department of Pharmacology and Toxicology，Shanghai Institute of Planned Parenthood Research，National Evaluation Center for the Toxicology of Fertility Regulation Drugs，Shanghai 200032，China+Correspondin
4、g author，Email：sunzy64163cornABSTRCT Objective：We affirmed a reliable method to judge the false positive result in Ames testMethods：In the plate incorporation test，we found that compared with the vehicle control group the colony number ofthe TA97 and TA 1 535 were remarkably increasedIn order to ver
5、ify whether it is because of the mutagenicity ofthe test compound or the toxicity of the compound，we en richment cultured the single colony which treatment withthe test compound or the positive control，then we streak inoculated the bacteria in the medium”without ldstidineto observe their growthResul
6、ts：The bacteria which treatment with the test compound can 7t grow in the mediumwithout histidinebut the bacteria treatment with the positive control canThat fact illustrated that the strainwhich treatment with the test compound did not mutate SO they couldn 7t grow in culture medium without histidi
7、neConclusion：This method can reliably verify whether the mutant strain is，from this study we could found that thetest compound doesnt make the strain mutation，the increasing result in the plate incorporation test was becauseof the toxicity of the compoundKey wordsAmes test；false positive；judgment me
8、thodAmes等经十余年努力tl-21，于1975年建立并不断发展完善的沙门菌回复突变试验(亦称Ames试验)，是一种快速检测化合物致突变性和潜在致癌性的方法”。l，目前已成为世界范围内基因突变检测中应用最为广泛的一种方法胪J，也是我国药物遗传毒性标准试验组合中必选的一项。鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型(异养型his一)菌株不能生长在缺乏组氨酸的培养基中，受诱变剂作用后，大量细菌发生回收稿日期：2013-0930基金项月：十二五“重大新药创制”科技重大专项(201 1ZX09301005)；上海市实验动物创新行动计划(11140901 300，11140901303)I二海市人才发展基金(2
9、010031)作者简介：陈颖(1986-)，女，研究实习员，硕土通信作者：孙祖越，(Email)sunzy64163corn复突变成野生型(原养型is+)，自行合成组氨酸，使其在缺乏组氨酸的培养基上也能生长发育成肉眼可见的菌落”。9】。在Ames平L掺入试验中，一般会在上层琼脂中添加少量组氨酸，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细菌外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落(即背景菌落)11010通常判断受试物毒性的方法是通过观察背景菌落的生长状态及琼脂培养基的清亮程度，一般来说背景菌苔生长良好时琼脂呈乳白色，若琼脂清亮透明，则说明背景菌苔生长不良，受试物具有细菌毒性。
10、但是，由于各厂家生产的琼脂质量不一，很难通过观察琼脂培养基来判断受试物是否具有细菌毒性，在低万方数据陈颖等：Ames试验假阳性的判断方法 243倍镜下观察背景菌落的生长状态也会受到琼脂的干扰而影响观察，因此这些方法并不可靠。在此，我们提供了判断Ames试验假阳性结果的可靠办法。1材料与方法11 材料5株标准测试菌株TA97、TA98、TAl00、TAl02和TAl535购自Mohox公司，在液氮或一80冰箱中贮存。阳性对照诱变剂为敌克松(Dexon)、叠氮钠(SA)(上海楷洋生物有限公司)，2一氨基芴(2一AF)、2一氨基蒽(2一AN)(Alfa Aesar公司)。菌株TA97、TA98、TA
11、l00和TAl02除具有组氨酸合成缺失突变外，还具有细胞壁脂多糖缺失突变(可增加受试物渗透进入细胞的能力)，含有pKMl01质粒(可增强细胞DNA损伤的误修复，促使有可能被修复的前突变转变为真正的突变，以提高菌株的敏感性，表现为具有氨苄西林抗性)1111。TAl535不含pKMl01质粒。TA97、TA98、TAl00和TAl535菌株具有切除修复系统缺失突变(紫外线敏感)；而TAl02则含有pAQl质粒，表现为具有四环素抗性。12抑菌试验根据国家食品药品监督管理局2007颁布的药物遗传毒性研究技术指导原则”21，对于可溶性的无毒化合物，推荐的最高测试浓度一般为5 mglI；对于可溶性的有细菌
12、毒性的受试物，应根据杀菌或抑菌情况确定最高浓度。因此，在抑菌试验中采用50、25、125、0625和03125 mg皿，对受试物的毒性进行检测。13正式试验根据抑菌试验中受试物的毒性情况确定最高浓度后，设计5个剂量组，在加或不加S9代谢活化系统的条件下采用平皿掺人法进行正式试验，同时设溶媒对照和阳性诱变剂对照。直接诱变剂敌克松为实验菌株TA97、TA98、TAl00和TAl02的诊断性阳性诱变剂；直接诱变剂叠氮钠为实验菌株TAl535的诊断性阳性诱变剂；间接诱变剂2一氨基芴为实验菌株TA97、TA98、TAl00和TAl02的诊断性阳性诱变剂；间接诱变剂2一氨基蒽为实验菌株TAl535的诊断性
13、阳性诱变剂。14验证试验在正式试验中发现部分菌株的菌落数有所增加，在不能确定受试物是否具有致突变效应的情况下，将10 mgII剂量作用的TAl535和o25 mg皿剂量作用的TA97中疑似突变的菌落，以及相应的阳性对照物作用的菌落进行增菌培养，划线接种于无组氨酸的底层琼脂培养基上，以验证增加的菌落是否为突变菌落。2 结果21抑茵试验结果在50 mglm剂量下5株菌均无菌落形成，在25 mgml剂量下仅出现极少量菌落，在125 mgnn剂量下各菌株菌落数明显少于自发回变菌落数，表明该化合物在上述剂量下具有细菌毒性。故正式试验中采用10 mg皿为最高剂量浓度。22正式试验结果采用平皿掺入法检测受试
14、物在10、05、025、0125和00625 mglm剂量下对测试菌株TA97、TA98、TAl00、TAl02和TAl535的致突变性时，发现TA97在05和025 mg皿剂量下，无论有无S9活化系统，对测试菌株TA97产生的回变菌落数与溶媒对照组相比呈增加趋势；TAl535在10 ragIS剂量下，无论有无s9活化系统，对TAl535产生的回变菌落数与溶媒对照组相比虽无统计学差异，但能观察到菌落数增加(表1，图1)。23验证试验结果给予受试物的菌株不能生长在无组氨酸的培养基上，而给予阳性对照物的菌株却可以生长在无组氨酸的培养基上，说明受试物造成的TA97和TAl535菌落数增加并非致突变作
15、用所致(图2)，而是毒性作用导致的假阳性结果。表l 受试物平皿掺入试验结果剂量s9(斗g皿)平均回变菌落数4(皿，x+s)TA97 TA98 TAl00 TAl02 TAl535a：3块平皿的平均值；$：与溶媒对照相比PO05万方数据244 舞 物I技 术H通 讯v州25 N【12 Mar,ETTERSN BIOTEC NOLOGY lal 2014I I H V1l lN【2 2u斗图1平皿掺入试验结果A97在不加S9的条件下溶媒对照组自发回变的菌落数，约为90一；B：TA97在不加S9的条件下025 m皿剂量下的菌落数，相比l对照组明显增多；C：TA97在不加s9的条件下阳性对照组Dexo
16、ni落数，相比溶媒对照组明显增多；D：TAl535在加s9的条件下溶r照组自发回变的菌落数，约为lO30；E：TAl535在不加S9的条：10 m皿剂量下的菌落数，相比溶媒对照组明显增多；F：535在不加S9的条件下阳性对照组sA的菌落数，相比溶媒对照j显增多讨论在验证试验中，经受试物处理的TAl535增菌后曳接种于无组氨酸的培养基，经培养产生了星星点的菌落(图2C、D)，可能在挑取菌落进行增菌培对挑取了部分发生自发回变的菌落，因此其可以民在无组氨酸的培养基中。受试物的毒性作用可以导致Ames试验出现假生结果，由于受试物杀死了大部分细菌，使残存的翦得以利用培养基中微量的组氨酸和生物素生长勾眼可
17、见的菌落，但这并非回变菌落，而是由供试荤性导致的假阳性结果。本试验能可靠地判断经式物处理的菌株是否为突变菌株，从而确定受试黾否具有致突变作用。考文献薛开先遗传毒理学讲座【J癌变畸变突变，1995，7(2)：124-128Alper M D，Ames B NPositive selection of mutants with de-letions of the galchl region of the Salmonella chromosomeas a screening procedure for mutagens that cause deletionsJJ Bacteriol，1975，1
18、21(I)：259-266图2验证试验结果A，B：上半部分为划线接种在无组氨酸培养基上，在加或不加s9的条件下经025 m皿受试物处理的TA97菌株，下半部分为经相应阳性对照物2-AF和Dexon处理的菌株；上半部分的细菌没有生长，而下半部分可以生长；C，D：上半部分为划线接种在无组氨酸培养基上，在加或不加S9的条件下经10 mgIm受试物处理的TAl535菌株，下半部分为经相应阳性对照物2一AN和SA处理的菌株；同样，经受试物处理的细菌没有生长，而经阳性对照物处理的细菌可以生长【3王明臣，张善锋，毛红丽，等Ames实验对叶黄素的致突变性与抗突变性研究【J】癌变畸变突变，2005，18(1)：
19、6567【4】周永贵，Chung K TAmes试验研究鞣酸和相关化合物的毒性和抗突变性J1环境与职业医学，2002，190)：23卜258【5】陆华，马康目，孙皎，等Ames试验与MLA试验检测两味含马兜铃酸中药的致突变性【J癌变畸变突变，2007，19(6)：4844866】邹琳，潘秀颉，吴维佳，等微量波动Ames试验在卷烟烟气毒理学评价中的应用研究【J】湖南农业科学，2010，(1 1)：82897胡燕平，马锐，宋捷，等蔡司多功能护理液的遗传毒性研究J1癌变畸变突变，2012，24(5)：379-382【8马茂才，黄萍，晏辉，等纳米二氧化钛和纳米氧化锌的Ames试验J癌变畸变突变，201
20、0，22(4)：3023049】汪希兰，杨光红，潘雪莉，等烯啶虫胺的致突变性试验J癌变畸变突变，2010，22(5)：397-400【10刘波，金建玲，张辉，等Ames测试不确定性分析【J】应用与环境生物学报，2007，13(5)：7267301 1】杨春梅，艾红军，张跃聚p一羟基丁酸酯材料的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验J】中国组织工程研究与临床康复，2009，13(21)：41374140【12】Mccann J，Spingarn N E，Kobofi J，et a1Detection of carcinogens as mutagens：bacterial tester strains with R factor plasmidsJProc Natl Acad Sci USA，l 975，72(3)：979983万方数据Ames试验假阳性的判断方法作者： 陈颖， 姜娟， 杨阳， 李莹， 周莉， 孙祖越， CHEN Ying， JIANG Juan， YANG Yang， LI Ying，ZHOU Li， SUN Zu-Yue作者单位： 上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室,中国生育调节药物毒理学检测中心,上海200032刊名： 生物技术通讯英文刊名： Letters in Biotechnology年，卷(期)： 2014,25(2)本文链接：http:/
