1、刚涉及 RNA 抽提的新手都会听到别人说 RNase 很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。于是在配制 tris 缓冲液时就遇到了两难的境地。 tris 缓冲液不能用 DEPC 处理，只能用DEPC 处理过的水配制，那么在药品称量、调 pH 值等过程中 tris 缓冲液会造到 RNase 的再次污染，所以是一个两难的境地。但是今天我要谈的是 RNase 并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。下面的实验照片（照片来自 ambion）很清楚的显示了高压灭菌的效果。实验很简单，将不同含量的 RNase 用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的 RNase 一起来降解 RNA（37度 1 小时） ，结果表
2、明，当 RNase 的污染量小于 100ng/ml 时，高压灭菌可以去除其活性。这张照片还说明了一个问题，当你的 RNA 溶液中含有很微量的 RNase 污染时，不用过于担心，因为 RNase 对 RNA 的降解是需要时间的，更何况你的 RNA 是存放在低温下的。DEPC 有致癌性，不能处理 Tris 溶液等这些事项大家都知道，所以不谈。谈一些实验室中的操作误区。误区一：重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。由于 DEPC 较贵，而且书上说DEPC 要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用 DEPC 的想法，即对含有DEPC 的水不进行高压灭菌，从而重复使用含 DEPC 的水处
3、理枪头、离心管等。节约本是好事，但这样的节约是无效的。为什么不能重复使用含 DEPC 的水，因为 DEPC 在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC 在 pH6.0 和 pH7.0 的 PBS 缓冲液中的半衰期分别约为 20min和 10min，DEPC 在水中的半衰期约为 30min。因此，重复使用含 DEPC 的水就不能保证枪头和离心管的 RNase-free。误区二：必需长时间高压灭菌来彻底去除 DEPC。用 DEPC 处理过的溶液，在 1520min的高压灭菌后还可以闻到一股特殊的香味，因此有人认为高压灭菌去除 DEPC 不彻底，所以要延长高压灭菌的时间以完全去除 DEPC。但是延长高压灭
4、菌的时间并不需要，因为闻到的特殊香味不是 DEPC 的，而是 DEPC 分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的 DEPC残留。误区三：溶液中 DEPC 含量约高，灭活 RNase 的效果越好。这个误区错了一半，的确，1% DEPC 能灭活高达 1000 ng/ml 的 RNase A，而 0.1% DEPC 只能灭活少于 500 ng/ml 的RNase A。但是溶液中残留的 DEPC 副产物会抑制一些酶反应，例如 DEPC 副产物会抑制体外转录反应，因此 DEPC 含量越高，高压灭菌后的 DEPC 副产物就越多，抑制
5、越明显。不少的文献都说，用 LiCl 沉淀 RNA 有很多好处，比如只沉淀 RNA，不会沉淀 DNA、蛋白和多糖等。但就是操作比较麻烦，比如，过夜沉淀，不能沉淀小分子 RNA 等。下面就LiCl 沉淀方法的误区进行探讨。误区一：LiCl 不能沉淀小分子 RNA。很多文献都说 LiCl 沉淀的 RNA 不含小分子的 5s rRNA 和 tRNA。但，事实是这样吗？至少在我的实验中发现 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。下面的图片更能说明 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。泳道 1 是 RNA maker，泳道 2、3、4 是用 LiCl 沉淀的 RNA。当然 LiCl 沉淀 tRNA 的效果真的
6、不好，其原因可能是 tRNA 的高度二级结构。误区二：LiCl 沉淀需要长时间和低温。不少文献上说 LiCl 沉淀需要 4 度、20 度、甚至80 度下放置 1 小时、2 小时、甚至过夜，其操作极其繁杂。但是，LiCl 沉淀真的需要长时间和低温吗？让我们来看看下面的数据：Lane 1, RNA marker. Lane 2, RNA centrifutged immediately without chilling. Lane 3, RNA chilled at -20C for 30 minutes before centrifugation. Lane 4, RNA incubated a
7、t 25C for 30 minutes to test precipitation time independently of chilling. Lane 5, RNA chilled at -20C for 1 hour. Lane 6, RNA incubated at 25C for 1 hour. 图片显示放置 30min 后，RNA 沉淀比不放置更有效（请比较泳道 2 和 3） ，但是比较泳道3、4、5、6 后，你会发现在20 度下沉淀与在 25 度下沉淀没有区别，放置 30min 与放置 1小时沉淀没有区别。但是建议大家用 -20C 30 minutes 的沉淀方法，因为低温能
8、降低 RNases 的活性（假设有痕量的 RNase 残留） 小提示：任何事务有利便有弊，LiCl 沉淀与乙醇沉淀相比，它的沉淀效率稍低。数据显示 2.5M 的 LiCl 的平均沉淀率是 74，而乙醇则是 85。通俗的说乙醇沉淀可以得到更多的 RNA。对于 LZ 发的帖子我很有兴趣，因为我们实验室很多试验都是从 RNA 起步的。谈谈我的观点。你所说的误区一：LiCl 不能沉淀小分子的 RNA。我赞同你的观点，因为我们是用 8M 的 LiCl 来沉淀 RNA 过夜，时间多半是大于 8h 的。但是我们电泳的结果仍然是可以见到 5S rRNA 的。用变性胶结果尤为明显，很清楚的三条带。不过我进实验室
9、之后，就再没人跑过变性胶，因为太麻烦。而且我看书上也说，仅仅是为了检测 RNA 的完整性，没有必要用变性胶。基于以上，我觉得 LiCl 可以更好的沉淀大分子核酸（好像是分子克隆上说的，看了记得不清楚了） ，但是分子克隆上没有说就不沉淀小分子核酸。呵呵。误区二：沉淀需要长时间和低温。首先说下低温，我们实验室有人做过比较，就是-20 度过夜后，早上转入-70 度半个小时，说沉淀的效果更好。时间长短，我是看了别人的论文改良CTAB-LiCl 法提取枣总 RNA 体系的建立 ，里面有一个试验是做 LiCl 沉淀的时间对比的，结论是沉淀过夜 RNA 的量最大。他的建议是沉淀至少 4h 以上以提高产率。这个我没做过，也不是很清楚。另外，我想请问下 LZ 这两张图，我看不明白。没见到所说的 RNA 的两条带啊。或者三条带。还有，我把自己以前看了几篇中文的关于 CTAB 方法提取 RNA 的各个试剂的作用的总结发上来，第一次发自己的东西，还请大家不要见笑。其实也是摘录了诸位作者的东西。
