1、植物原生质体分离及融合,10级生物技术 冯德,实验目的,学习植物原生质体分离的方法了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法,实验原理,植物细胞相比于动物细胞具有一层细胞壁，当将细胞壁除去后就可以得到裸露的球形细胞，称之为原生质体。分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁，即具有细胞全能性。细胞壁的主要成份是纤维素、半纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶，果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁。,由于质膜完全暴露，原生质体具有摄取大分子(如核酸)、细胞器(如核、叶绿体)和细菌、病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料。而原生质体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚
2、乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生物类型。,现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，2050的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。,PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、碳水化合物等一些基团形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组。由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。,实验用品,(
3、一)材料：植物叶片(菠菜叶片)(二)用具：倒置显微镜，离心机。过滤筛(100目)，漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注射器(510m1)等；(三)试剂：1、纤维素酶2，果胶酶l。 2、016M CaCl22H20溶液(内含01MES)PH56。3、22蔗糖溶液。4、30聚乙二醇(PEG)溶液5、高PH高钙洗脱液(PH=9)6、024M CaCl22H20,实验方法,(一)原生质体的分离收集 取菠菜叶片撕去下表皮，每小组称02g切成小块放到10ml酶液中在26下酶解45小时，或酶含量减半过夜，期间轻摇几次100目的过滤筛过滤用与滤液等体积的0.16M CaCl22H20溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤
4、液滤液用离心机100300rpm，离心5分钟弃上清沉淀中加入0.16M CaCl22H20溶液12ml，轻摇使之悬浮用注射器自离心管底部轻轻地加入68ml22蔗糖溶液，使之形成界面,静置待原生持体形成一条带时弃去上、下液及残渣用吸管吸取收集原生质体用0.24M CaCl22H20溶液洗涤一次，离心吸去上清液沉淀中加入1-2ml 0.16M CaCl22H20溶液悬浮沉淀用血球计数板计数，使原生质体密度为2105个ml取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性,(二)原生质体融合操作1、取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。2、在两滴悬液之间加1滴30PEG液，使3滴淀液相连，室温下(15一20)作用5-10分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。,原生质体融合的作用1、可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲和性。2、可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广。3、一次操作可实现两个以上亲本的融合作用。4、可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种。5、可形成有性生殖障碍植物的种间杂种。,
