1、华中农业大学学士学位论文学士学位论文文 献 综 述题 目 绿色荧光蛋白的应用及发展前景姓 名 周紫嫣学 号 014010110349专 业 生物工程指导教师 周小萍职 称 教师中国武汉二一二年四月华中农业大学学士学位论文I目 录摘 要 II关键词 IIAbstractIIKey wordsII1 GPF 的发现 12 GFP 的结构及发光原理 12.1 GFP 的结构 12.2 GFP 的发光原理 23 GFP 在生物技术中的应用 23.1 GFP 作为报告基因 23.2 GFP 用于研究病毒与宿主的关系 33.3 GFP 用于药物筛选 33.4 GFP 作为生物传感器 33.5 GFP 用于
2、融合抗体 43.6 GFP 用于计算细胞生长速度 43.7 GFP 用于基因表达调控 44 GFP 存在问题及发展前景 4参考文献 5致 谢 5华中农业大学学士学位论文II绿色荧光蛋白的应用及发展前景摘 要绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母（Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由 238 个氨基酸构成，第 6567 位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。本文综述了绿
3、色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景。关键词绿色荧光蛋白；报告基因；药物筛选；融合抗体Green fluorescent protein application and development prospectAbstractGreen fluorescent protein (GFP) is a kind of the jellyfish (Aequorea Victoria) found in the body of the luminous protein. Molecular quality as kDa 26, with 238 amino acids, 65 67 of
4、 amino acid (Ser-Tyr-Gly) form shine group, is mainly the position of the light. The light the formation of the group has no species specificity, a fluorescent stability, and does not need to rely on any auxiliary factors or other matrix and shine. Green fluorescent protein gene into the host cell i
5、s stable, for most of the host physiology no effect, the report is a common gene. This paper reviewed the green fluorescent protein discovery process, basic properties, application and development prospect.Key wordsGreen fluorescent protein；Report gene；Drug screening；Fusion antibody华中农业大学学士学位论文11 GP
6、F 的发现2008年的诺贝尔化学奖授予从事有关:“绿色荧光蛋白( GFP) 的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：日本科学家下村修（Osamu Shimomura）；美国科学家马丁沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）。绿色荧光蛋白( GFP) 是一种在维多利亚多管水母体内所发现的蛋白质。是在1962年由下村修等科学家发现。而水母所发出的绿色荧光,并非由GFP发出,它是因照相中所使用闪光的反射所致。2 GFP的结构及发光原理2.1 GFP的结构由维多利亚多管水母中发现的GFP是一种化学性能稳定的小分子蛋白质，由238个氨基酸残基组
7、成。在蓝色波长范围的光线激发下，发出绿色萤光。GFP的原初结构式通过氨基酸残基65-67(Ser-Tyr-Gly)而生成的荧光发色团(Cody et al，1993)。在GFP的65-67(Ser-Tyr-Gly)可自发的形成一种P-羟基亚苄基咪唑酮的荧光发色团（如图1所示）。图1 发色团华中农业大学学士学位论文2GFP的晶体结构是11个-折叠组成的-桶状结构组成的二聚体，在桶中央有一个-螺旋。-桶状结构直径约3nm，高约4nm。-折叠彼此紧密结合，像桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带（如图2所示）。桶状结构和位于其末端的短-螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没
8、有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点（Yang F et al，1996）。蛋白的一级结构大部分用来形成-折叠和-螺旋。蛋白质原初结构中,很大一部分用于构筑-管道，以及线状的-螺旋体。在能保持GFP荧光发射的条件下，从GFP的N2端和C2端可以除去的N2端残基和C2端的残基(总数达230238) 是无序的（吴世康，2008）。图二 GFP的晶体结构2.2 GFP的发光原理GFP的激发光谱在400nm处有一主要激发峰，在470nm处有一次要激发峰，发射光谱在505nm处有一尖锐的主要发射峰，在540nm处有一肩峰。这一结果是于1998 年,由Tsien所测得。
9、GFP的性质和发射光谱的稳定性与其生色团结构的稳定性紧紧相关。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使得66位氨基酸残基的，键间脱氢。由6567位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化成稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团（吴沛桥等，2009）。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要氧使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射（徐飞虎和龚兴国，2002）。3 GFP在生物技术中的应用3
10、.1 GFP作为报告基因报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如荧光素酶(LUX)基因和-葡萄糖苷酶(GUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测（吴沛桥等，2009）。常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ ,是利用酶促催化反应,需要加入外源底物和诱导物(如IPTG,X-gal) ,不仅操作繁琐且价格昂贵。现已构建了以GFP S65 T 基因作为筛选标记的新型克隆载体,建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法（孙德惠等，2006；范学政等，2005）,替代LacZ 蓝白斑筛选
11、,不需X-gal ,经济简单可行。作为一种新的报告基因，GFP在生物学研究中得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机原理，可将GFP作为蛋白质标签，利用DNA重组技术将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，所以将其和其他蛋白融合不会影响自身发光。1996年，Ehrdardt等人首次报道利用GFP研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成一个环状物，并且至少有9种蛋白在细胞分裂中起到重要作用，虽然对这些蛋白功能并不是很清楚，但是利用GFP已经搞清楚他们聚合的华中农业大学学士
12、学位论文3顺序及蛋白定位中的一些特征。除了用于蛋白的标记定位之外，GFP也可以大量用于细胞器的标记。3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系将病毒用GFP活体标记,可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的系。在研究病毒与宿主关系时，如果用荧光染料标记病原菌的方法，由于病原菌的分裂，染料被稀释，长期以来未取得病原菌侵入活细胞的实时实态过程，而用放射性的核酸探针法及gus等报告基因引入病毒基因组作为报告物等方法必须在分析前对组织进行处理，这样就阻止了感染的继续进行，而GFP基因则能有效克服上述不足（杨朝辉和雷建军，2000）。Casper将GFP基因插入TMV的基因组体外转录获得感染性R
13、NA，然后导入烟草植株，观察发现在接入点和整个植株均可表达GFP(袁小松和沈继龙，2006)。并发现在系统感染中病毒以两种方式进行运动：一是细胞间慢的传播，伴随病毒复制的GFP表达；二是维管介导的快速运转，病毒不复制，GFP不表达（王晓丽等，2008）。Oparka将GFP编码基因置于根瘤菌组成型启动子之后，利用GFP产生的绿色荧光可清楚的观察到根瘤菌对植物的侵染过程和与之共生的情况。Barret t M等将GFP克隆于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体启动子下游,发现感染24h后在昆虫的中肠上皮细胞和血细胞中发现绿色荧光,表明在这些组织中病毒复制表达了极晚期蛋白,随后的感染发生在整个体腔的气
14、管细胞,并进而发生在其他组织。3.3 GFP用于药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所需要的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化（Jesus E G,et al,1998）。荧光探针分布式利用了信号传导中信号分子的转移功能，将荧光蛋白和信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布可推断信号分子的转移情况，并推断出该分子在转移中的功能。而由于GFP的相对分子量小，可活细胞内可溶对细胞毒性较小，所以常作为荧光探针。当细胞体内风信号分子和某一特
15、殊受体结合常常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域转移到另一细胞区域，这些受体常被用来做药物筛选的目标，若某一药物具有和信息分子类似的功能，那么该药物就具有潜在的医药用途。利用GFP荧光探针，容易从总舵的化合物中判断哪些具有和信号分子相似的功能，并且这种筛选过程简单方便，成本也很低。利用这个原理已成功构建一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体（hGR）的转移过程(Steven R K,1999)。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。3.4 GFP作为生物传感
16、器绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于 GFP 的生物感受器为钙离子感受器，由 Romoser 和 Miyawaki 几乎同时提出。原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种 GFP 突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到 GFP 上以构建新的分子感受器。Doi 和 Yanagawa 根据这一原理将 TEM1 -内酰胺酶 (Bla)融合到 GFP
17、上。当缺少目标分子时，GFP 处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子 -内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)与 Bla 结合后，即使 GFP 活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到 GFP 表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种 GFP 感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。野生型GFP和其很多突变体都具有依赖pH的荧光变化，可用来检测活细胞内的pH。称为Phluprin可分为：比率Phluorin和盈缺Phluorin。当pH降低时，比率Phluorin的最大激发波长从395nm到华中农业大学学士
18、学位论文4475nm迁移，利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量pH；当pH值小于6时，盈缺Phluorin在475nm处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluorin都会在20 ins内复原。Hanson等19在2002年就设计了一系列GFP突变体deGFP，作为双波长比率测量的pH探针，用于细胞内检测。另外GFP也可用于检测电位、氧化还原水平(J Yh R,2000)。3.5 GFP用于融合抗体单链抗体是基因工程抗体中研究较多的一种小分子抗体，它的优越性在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来有许多关于GFP融合单链抗体的研究，如程虹等报道将抗
19、肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功(程虹等，2001)。因为融合抗体具有与抗原结合及发射荧光这两种特性，所以这种人工分子可以用做免疫染色的检测试剂，直接应用在流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤检测等。由于技术原因，一般融合抗体均置于原核表达系统中。为了便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入-6His序列，便于用NiNTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但是由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗
20、原结合活性的单链抗体(Mhashilkar A M，et al,1995)。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。3.6 GFP用于计算细胞生长速度在高水平组合型表达GFP的细胞品系中，在细胞生长对数期，GFP所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量的任何荧光强度都可相应的转变成细胞浓度。尽管在细胞生长后期，用荧光信号计算得到的细胞数略低于培养物中的实际数目。但是在常用的台盼蓝计数法中，这个误差是允许的(何海建和陈婷飞，2008)。3.7 GFP用于基因表达调控Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter report
21、er vector) 即是一个没有启动子的GFP质粒, 专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率, 以及某些增强子对GFP 表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK 基因5 端的非翻译片段(5VTR)与花椰菜花叶病毒的35S 启动子连接, GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S 启动子)提高近15倍，因为5VTR 片段中含转录增强子。用拟南芥菜热休克(Heat- shock)基因启动子构建GFP表达载体, 用以转化玉米原生质体。发现42热激处理中50%原生质体表达GFP 荧光, 37处理的荧光较弱, 而常温下培养, 则完全观察不到原生质体中的GFP荧光（薛启汉，1999）。4 G
22、FP存在问题及发展前景由于荧光蛋白自身发射荧光的特性，发光不需要其他协助因子，荧光生色团对热、pH、化学变性剂稳定，且具有比较强的抗光漂白性质。使得GFP在生物学的众多研究领域中有着广泛的应用，但是也存在着一些不足。如检测灵敏度有待提高且其荧光信号强度方面的非线性性质使定量困难；紫外激发对某些GFP有光漂白的光破坏作用，导致荧光信号快速丧失；多数生物具有微弱的自身发光现象，影响某些GFP的检测；新生GFP通过折叠加工成为具有活性的形态，过程十分缓慢等。考虑上述问题，GFP要在各领域得到更加全面的应用，还需要几个条件：基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的融合。与此
23、同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，我们相信，GFP一定会给我们带来更多的应用价值。华中农业大学学士学位论文5参考文献1 程虹等,2001,世界华人消化杂志,9(6):640-644.2 范学政,王琴,陈振海,等.绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2 基因在杆状病毒中的融合表达J.中国兽医学报,2005,25(6):5642565.3 何海建;陈婷飞,绿色荧光蛋白及其在分子生物学上的应用,浙江大学动物科学院,321009.4 孙德惠,独军政,常惠芸,等.口蹄疫病毒3ABC 绿色荧光蛋白载体构建及表达J.动物医学进展,2006,27(4):72274,106.5 王晓丽等,绿色荧
24、光蛋白的研究进展,动物医学进展,2008,29(1):56-59.6 吴沛桥等,绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用,2009,28(1):83-86.7 吴世康,绿色荧光蛋白质( GFP) 的发现、表达和发展,中国科学院 理化技术研究所,北京100190.8 徐飞虎;龚兴国,绿色荧光蛋白应用研究进展,细胞生物学杂志,2002,杭州,310027.9 薛启汉,绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备J.江苏农业学报,1999, 15(1):52-5810 杨朝辉;雷建军,GFP基因研究进展,生物学杂志,2000,10,17(5).11 袁小松;沈继龙.增强型绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫成虫体内的
25、时表J.中国人兽共患病学报,2006,22(1):18222.12 Cody C W,Prasher D C,et al.Chemical structure of the kexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent proteinJ.Biochemist ry ,1993,32:121221218.13 Jesus E G,et al.,1998,Current Op inion in Biotechnolo-gY,9:624-631.14 J Yh R,Hliikle PM.Rapid turnover of calc
26、ium in the endoplamie rttieulum during sigmaing.studies with cantleofl calcium inaieatorsJ.J Biol Chem.2000.275:23648-2365315 Mhashilkar A M,et al.,1995,EMBO J,14:1542-1551.16 Steven R K.,1999,DrugDiscovery Today,4(7):304-312.17 Yang F,et at,1996,Nat.Bfotechno1，l4(10):1246-1251.致 谢历时近一个月的时间终于将这篇论文完成，在写论文的过程中遇到的困难和障碍，都在同学和老师的帮助下度过了。尤其要感谢我的论文指导老师，她对我进行了无私的指导和帮助，不厌其烦的帮助进行论文的修改和改进。在此向帮助和指导过我的各位老师表示最衷心的感谢！感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我很难完成本篇论文。感谢我的同学和朋友，在我写论文的过程中给予我了很多相关素材，还在论文的撰写和排版过程中提供热情的帮助。由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！
