1、Validation of Analytical Procedure 分析方法验证 徐禾丰 第三部分: 盐酸氟西汀验证实例第-2- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 1.1目的 掌握色谱方法验证所需要的项目 掌握色谱验证基本实验方法 了解稳定性指示性方法验证的要求 了解析因分析在验证中应用第-3- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 1.2简介 美国某公司生产10mg 和20mg 盐酸氟西汀两种相胶囊 其重量与配方相同 仅盐酸氟西汀与辅料比例不同 所验证方法是公司内部对美国和欧盟市场产品产品放 行和稳定性研究中使用的含量和杂质分析的方法 该分析方法已经建立第-4- 页 人用药
2、注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 1.3验证项目清单 1. 精密度 2. 线性 3. 范围 4. 准确性 5. 低浓度盐酸氟西汀验证 6. m- 盐酸氟西汀验证 7. 选择性 8. 耐用性第-5- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2.0精密度 项目: 系统重复性 方法重复性 中间精密度第-6- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2.1系统重复性 方法 按照分析方法要求, 配制盐酸氟西汀标准溶液 重复进样5 次 计算 峰面积平均值与相对标准偏差第-7- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2.2方法重复性 方法 按照分析方法要求, 分别配制20mg 盐酸氟西汀 样品
3、溶液6 个 分别进样 计算 含量相对标准偏差第-8- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2.3中间精密度 方法 由另外一个分析员, 在不同日期, 另外的仪器上, 按照分析方法 分别配制20mg盐酸氟西汀样品溶液6 个 计算 含量及相对标准偏差第-9- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3.0线性 方法 正常含量分析用标准溶液浓度的50% 到200% 范围内 均匀选择5 个点 并配制相应浓度的盐酸氟西汀含量标准溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数, 斜率,Y 轴截距第-10- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4.0范围 方法 正常20mg样品含量分析浓度5
4、0% 到200% 范围 内 均匀选5 个点 配制盐酸氟西汀样品溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数, 斜率,Y 轴截距第-11- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5.0准确性 项目: 标准品准确性 样品准确性第-12- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5.1标准品准确性 方法 按照分析方法要求, 配制盐酸氟西汀标准溶液 重复进样5 次 计算 准确性 测定浓度值用峰面积按照回归方程进行 计算第-13- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5.2样品准确性 方法 按照产品的标示量, 在70% 到180%正常标示量 选均匀选择4 个点, 混合辅料与及盐酸氟西汀
5、 每点3 个样品, 分别进样 计算 回收率 测定浓度值用峰面积按照回归方程进行 计算第-14- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.0低浓度盐酸氟西汀验证 项目: 线性 准确性 系统重复性 定量限度 检测限度第-15- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.1线性 方法 按照分析方法要求, 均匀选择6 个点, 配制标示量 的0.02% 到1.0% 含量标准溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数, 斜率,Y 轴截距第-16- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.2准确性 方法 配制杂质浓度的标准溶液 进样6 次 计算 按峰面积用回归线性方程来计算测量浓度
6、平均值, 相对标准偏差第-17- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.3系统重复性 方法 配制工作浓度的0.02% 和0.05% 标准溶液 分别进样6 次 计算 峰面积的平均值与相对标准偏差第-18- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.4定量限度 用系统重复性实验中的标准偏和线性回归方程中的斜 率差计算第-19- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6.5检测限度 用系统重复性实验中的标准偏和线性回归方程中的斜 率差计算第-20- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.0 m- 盐酸氟西汀验证 项目: 线性 检测限度 定量限度 准确性 精密度 方法重
7、复性 中间精密度第-21- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.1 m- 盐酸氟西汀简介 m- 盐酸氟西汀是产品中的一个杂质 m- 盐酸氟西汀在0.05% 1.0% 区间呈线性 相对响应因子( 对盐酸氟西汀) F=132.73952/74859534=1.8第-22- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.2定量限度 根据 盐酸氟西汀定量限度 相对响应值 计算盐酸m- 氟西汀定量限度第-23- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.3检测限度 根据 盐酸氟西汀检测限度 相对响应值 计算盐酸m- 氟西汀检测限度第-24- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰
8、 7.4回收 方法 分别6 个标空白中加0.05% 的m- 盐酸氟西汀 进样 计算 回收率 实际检测值用峰面积按照回归线性方程 计算第-25- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.5准确性 方法 在已知m- 盐酸氟西汀含量的样品中分别在 0.4%,0.5%和0.6%3 个水平加入m- 盐酸氟西汀 标准品 每组3 个样品中 计算 回收率 实际检测值用峰面积按照回归线性方程计算第-26- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.6重复性 项目: 方法重复性 中间精密度第-27- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.61方法重复性 方法 按照要求配制溶液 反复进样6
9、次 计算 平均值 标准偏差 相对标准偏差第-28- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7.62中间精密度 方法 另外一个分析员, 在不同日期, 另外的仪器上按 照方法重复性方法 配制溶液6 次 分别进样 计算 含量及相对标准偏差第-29- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.0选择性 1. 降解 1) 原样 2) 酸降解 3) 碱降解 4) 氧化降解 5) 日光降解 6) 溶液加热降解 7) 粉末加热降解 2. 系统适应性 3. 空白第-30- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.1简介 降解产物的选择性试验是分析方法稳定性指示性验证 的一个重要部分 主要目的
10、是通过试验证明各种降解的产物与所要分析 的物质可以完全分开 本试验中的主要设备是二极管矩阵检测器。并通过计 算: 纯度角, 匹配角, 纯度阈值, 匹配阈值, 含量来证明峰 的纯度第-31- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.2原样品 方法: 20mg胶囊按照规定的方法进样分析 标准品按照规定的方法进样分析第-32- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.3酸降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 并超声处理10 分钟。加1ml 的浓盐酸。 放置18 小时。用10N 氢氧化钠中和到pH5.5。稀释到 刻度。
11、过滤。 标准品: 称量大约22mg的标准品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 加2ml 的盐酸。放置18 小时。用10N 氢氧化钠中和到pH5.5 。稀释到刻度。第-33- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.4碱降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 并超声处理10 分钟。加1ml 的5N 氢 氧化钠。放置18 小时。用5N 盐酸中和到pH5.5 。稀释 到刻度。过滤。 标准品: 称量大约22mg的标准品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 加2ml 的5N 氢氧化钠。放置18
12、小时。 用5N 盐酸中和到pH5.5。稀释到刻度。第-34- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.5氧化降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 并超声处理10 分钟。加1ml 的30% 过 氧化氢。放置5 小时。稀释到刻度。过滤。 标准品: 称量大约22mg的标准品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂,2ml 的30% 过氧化氢。放置5 小时。 稀释到刻度。第-35- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.6光降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品。在500w/hr.cell 下
13、曝 光1 小时。设定BST35 C,ACT45 C 。 标准品: 称量大约等量20mg的样品。在500w/hr.cell 下 曝光1.5小时。设定BST35 C,ACT42 C 。第-36- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.7溶液加热降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品, 转移到50ml 容量瓶中, 加入20ml 稀释剂, 并超声处理10分钟。稀释到刻度。 取4ml 溶液并转移到坩埚内。与105 C 加热2 小时。冷 却到室温。过滤。 标准品:4ml 的工作标准液转移到坩埚内。与105 C 加 热2 小时。冷却到室温。过滤。第-37- 页 人用药注册技术要求国际协
14、调会议 徐禾丰 8.8粉末加热降解 方法: 样品: 称量大约等量20mg 的样品, 转移到合适的试管中。 于100 C 加热4 小时。冷却到室温。转移到50ml 容量 瓶, 加入20ml 稀释剂, 并超声处理10分钟。稀释到刻度。 过滤。 标准品: 称量大约等量45mg的标准品, 转移到合适的试 管中。于100 C 加热4 小时。冷却到室温。转移到 100ml 容量瓶。稀释到刻度。过滤。第-38- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.9系统适应性 系统适应性按照规定方法进行。 氟西汀与m- 氟西汀间分离度应不小于2.0 。 氟西汀峰拖尾因子应不大于2.0 。 氟西汀的典型保留时间大
15、约在9.5 到10.0分之间。第-39- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8.10空白 分析两个批号的空白与氟西汀, 并分析混合样品 没发现干扰峰第-40- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 9.0标准与样品溶液的稳定性 项目: 标准溶液 样品溶液第-41- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 9.1标准溶液稳定性 方法: 配制标准溶液, 冷藏于4 C 8 C 放置30天以上 与两个新配制的标准溶液一道测试第-42- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 9.2样品溶液稳定性 方法 配制样品溶液, 冷藏放置48 小时 重新分析第-43- 页 人用药注册技术要
16、求国际协调会议 徐禾丰 10.0耐用性 项目: 提取效率 析因设计第-44- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 10.1提取效率 方法 取三个样品, 按照要求配置溶液, 但超声分为 5,10 和15 分钟 每个样品测定3 次第-45- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 10.2析因设计因素 UV detector = 227nm, Flow Cell = 10mm. 检测器 10 L 进样量 三乙胺缓冲液: 乙腈: 四氢呋喃(65:20:15) 溶液B 溶液B 稀释剂 30 C ( 2 C) 温度 1.4 1.6mL/min 流量 三乙胺缓冲液: 乙腈: 四氢呋喃(75:1
17、5:10) 溶液A 溶液A:溶液B(55:45) 流动相 Shandon, Hypersil BDS C-8, 5 , 150 4.6mm 柱 规格 项目第-46- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 10.3 析 因设计参数 流动相构成 流量参数 柱温 柱生产商第-47- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 10.4 柱 生 产 商 Hypersil, BDS C-8, 5u, 150 x 4.6mm 60 1.0 27 -1 Shandon, Hypersil, BDS C-8, 5u, 150 x 4.6mm 55 1.5 30 1 柱型号 溶液A (%) 流量 (mL/
18、min) 柱温 ( C) 事件第-48- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 10.5 析 因 设 计 15.7 2.8 1.4 -1 -1 -1 -1 8 15.2 2.8 1.5 1 -1 1 -1 7 14.8 2.8 1.3 -1 -1 1 1 6 13.4 2.8 1.5 1 -1 -1 1 5 10.6 2.7 1.4 -1 1 1 -1 4 9.9 2.7 1.3 1 1 -1 -1 3 9.6 2.6 1.3 -1 1 -1 1 2 9.4 2.6 1.5 1 1 1 1 1 保留时间 min 分离度 拖尾 因子 柱温 ( C) 流量 (ml/min) 柱 溶液A (%) 序号第-49- 页 人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 讨论 本验证方法中有什么优点, 缺点? 什么项目的方法可以改进? 我们自己所做的验证有什么不足?Validation of Analytical Procedure 分析方法验证 徐禾丰 第三部分: 盐酸氟西汀验证实例
