1、二、 质粒的提取和纯化所需1. 液体 LB 培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE） 1%(g/ml)NaCl 1%酵母粉（YEAST EXTRACT） 0.5%加蒸馏水定容（2 ）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于 4 度保存备用，使用时恢复室温（3 ）配液体 LB 培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜 4 度保存） ，因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体 LB 培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE） 1%(g/ml)NaCl 1%酵母粉（YEAST EXTRACT） 0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中） ，由于加入的琼脂粉有一定的体积
2、，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的 LB 中加入加琼脂粉 1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子 15min，点燃酒精灯。若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效） ，根据比例加入抗生素后在铺板。培养基铺到平板上，每个平板约 25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应
3、不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约 15min）（5 ）待 LB 培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到 4保存备用3. 配置含有抗生素的 LB 培养基Amp 配制时一般为 100g/ l, 使用时稀释 1000 倍Kana 配制时一般为 50mg/ml，使用时稀释 1000 倍二、质粒转染真核细胞1、 lipo2000（以 6 孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1 ）将覆盖率为 90-95%的细胞提前用 only 饥饿 3h，转染前换新鲜培养液。（2 ）取质粒 4g 稀释到 250Lonly 体系中，
4、同样取 lipo2000 试剂 10L 稀释到 250L体系中，室温静置 lipo2000 稀释液 5min（注意避免不要使 lipo2000 直接接触塑料且静止时间不要超过 5min） 。（3 ） 5min 后将质粒稀释液加入到 lipo2000 稀释液中，颠倒混匀后室温静置 20min（注意不要超过 20min） 。（4 ）将孵育好的混合物缓慢匀速加入 6 孔板中，且最好边加边晃动板子，避免 lipo2000局部毒性对细胞造成损伤。（5 ）加完后放入 37培养箱内培养，转染 6h 后更换新鲜培养液。（6 ） 24h 显微镜下观察细胞状态及时处理（如荧光强弱、传入 10cmdish 内等） ，如需药筛48h 后即可加药，筛选稳定克隆。2、 Fugene（以 6 孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1 ）取覆盖率为 80-90%细胞更换新鲜培养液。（2 ）取质粒 3g 以及 fugene9L 按先后顺序加入到 150L only 体系中，室温孵育12min。（3 ）将孵育好的混合物缓慢加入 6 孔板内，边加边晃动。（4 ） 24h 后观察细胞状态换液，48h 后可以进行药筛筛选克隆。
