1、1选修 1生物技术实践第一部分 微生物的利用实验 1 大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌1大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌 ，为兼性厌氧的肠道杆菌。2用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。本实验用 LB 液体培养基 （通用的细菌培养基） 扩大培养大肠杆菌，培养后用 LB 固体平面培养基进行划线分离。三、 细菌的培养和分离1细菌的培养：（1 ）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约 20min 分裂一次。（2 ）培养的方法：需要将已有细菌的培
2、养物 转移到新的培养基 中，一般用接种环来转移带菌的培养物。2细菌的分离分离的方法与特点：划线分离法：操作简单。 （接种环）涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。 （玻璃刮刀）四、灭菌操作1灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染 。2无菌操作的条件：（1 ）各种器皿必须是无菌的。 （首要条件）（2 ）各种培养基必须是无菌的。“细菌喜荤，霉菌喜素”细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压。在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度） 。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的环境中生长（制备培养
3、基时需调节培养基的酸碱度） 。2如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用 500g/cm2 压力（90 以上）灭菌30min.3灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。 （1 ）灼烧灭菌（2 ）干热灭菌：160-170 下加热 1-2h。（3 ） 高压蒸气灭菌：100kPa 、121 (1kg/cm 2)下维持 15min.（4 ）过滤灭菌：G6 玻璃砂漏斗过滤（用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解）4消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法（1 ）煮沸消毒法：100煮沸 5-6min（2 ）巴氏消毒法：70-75 下煮 30min 或 80 下煮 1
4、5min（3 ）化学药剂消毒法：用 75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源（4 ） 紫外线消毒五、大肠杆菌的培养和分离实验1实验步骤：（1 ）培养基灭菌：将 50mlLB 液体培养基、50mlLB 固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好进行高压蒸汽灭菌。 （封口膜的作用是既通气又不使菌进入）（2 ）倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放到 超净台 上，打开紫外灯和过滤风（3 ）接种：接种环接种，在 37振荡培养 12h（4 ）划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在 37恒温培养箱中培养 12-2
5、4h，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。（5 ）菌种保存：用接种环取出 单菌落，用划线法接种在斜面 上，37培养 24h 后，置于 4冰箱中保存3实验 2 分离以尿素为氮源的微生物一、脲和脲酶1脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。2脲酶：有些细菌可以尿素为 氮源，这些细菌含有脲酶（1 ）可降解尿素的酶（2 ）作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成 NH3，致使 pH 升高，使酚红指示剂变红。二、实验设计及步骤1实验中的对照设置：实验组：以全营养 LB 固体培养基 进行培养（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水）对照组：以尿素固体培养基进行培养（葡萄糖，氯化钠，K 2HPO4，酚红，琼脂糖，
6、水）加入通过 G6 玻璃漏斗过滤（使之无菌）的 10ml 尿素溶液（内含 2g 脲）2实验步骤：（1 ）制备培养基：将已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。（2 ）制备细胞悬液：用 1g 土样配制不同浓度的细胞悬液（加无菌水稀释） 。（3 ）用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有 LB 培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在 70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭。在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。（4 ）培养：倒置培养皿，在 37恒温培养箱中培养 24-48h（5 ）观
7、察：培养基中的菌落数。4实验 4 果汁中的果胶和果胶酶一、果胶1化学组成：半乳糖醛酸和 半乳糖醛酸甲酯2作用：（1 ）植物细胞壁的主要成分（2）将植物细胞粘合在一起（去掉果胶植物组织变得松散）3鉴别方法：果胶不溶于酒精二、果胶酶1来源：黑曲霉、苹果青霉等微生物2作用：3应用：（1 ）应用原理：水解果胶，使水果组织的分散性加大。（2 ）果汁生产：提高出汁率和澄清度。三、探究制作果汁的最佳条件实验流程：95%的乙醇用于检验是否有果胶如果有浑浊（或者沉淀） ，说明果胶还没有被完全水解。如果澄清，说明果胶被完全水解5实验 6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、酶1功能：是生物体内各种化学反应的催
8、化剂2特性：专一性和高效性3应用的特点：在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。二、固定化酶1概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。2酶固定化的方法：吸附法、共价偶连法、交联法、包埋法等。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。三、-淀粉酶的固定化1固定化原理：利用吸附法将 -淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成这里使用的是枯草杆菌的 -淀粉酶，其作用的最适温度为 5075；最适 PH 为 5.57.52固定化过程：（1）在烧杯中
9、将 5mg-淀粉酶溶于 4ml 蒸馏水中（由于酶不纯，可能有些不溶物） 。（2）再加入 5g 石英砂,不时搅拌（3）30min 后装入 1 支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约 4ml)（4）用 10 倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为 1ml/min3步骤：（1）淀粉溶液流经固定化酶柱：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以 0.3ml/min 的流速过柱。（2）接取流出物：在流出 5ml 后接收 0.5ml 流出液。（3）流出物的鉴定：加入 12 滴 KI-I2溶液,观察颜色.用水稀释 1 倍后再观察颜色。（4）洗涤
10、、保存固定化酶柱：用 10 倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在 4冰箱中保存。6（5）几天后取出冰箱中该固定化酶柱，再重复上述实验,看是否有相同的结果。 （可重复使用）控制流速的目的是使淀粉溶液与淀粉酶充分接触。洗涤固定化酶柱的目的是洗去残留的反应物和产物。实验 8 果酒及果醋的制作一、用葡萄制作葡萄酒1实验原理：（1 ）与制作葡萄酒有关的微生物：酵母菌（2 ）制作葡萄酒所需原料：葡萄（3 ）制作原理：酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵C6H12O6 2CO2 + 2C2H5OH（4 ）当培养液中乙醇的浓度超过 16%时，酵母菌会死亡。2实验步骤：（1 ）冲洗：洗净成熟葡萄，并在高锰酸钾溶液中浸泡，
11、然后用水洗净。（2 ）榨汁：用榨汁机以低速 将葡萄打成浆状（3 ）制作酵母悬液：干酵母 加水制成糊状，加少许（一小撮） 蔗糖，混匀，放置片刻，至酵母悬液中出现气泡。（4 ）装入发酵瓶：将葡萄浆放入发酵瓶中，装量不要超过 2 / 3，然后加入酵母悬液，搅拌均匀，瓶上加软木塞或橡胶塞，塞上带有弯曲玻璃管（加水，防止 O2 进入，空气中杂菌污染） 。（5 ）酒精发酵：在 25-30C 条件下放置 2-3 天，若温度偏低，则发酵时间延长；若温度高于30C，要采取降温措施，否则酒的风味不佳。（6 ）过滤、分装、保存：用两层纱布过滤发酵液，除去葡萄皮和籽。同时可以用洗干净的手挤压滤渣，以获得尽可能多的葡萄
12、酒，分装到 1-2L 细口瓶中，加盖密封，静置。待沉淀后，上清液即为葡萄酒。用这种简单工艺制造的葡萄酒，常温下可保存 1-2 年。二、用果汁制作果酒1制作果酒材料（1 ）苹果（最好） 、梨、柑橘或其他水果7（2 ）新鲜酵母或干酵母2实验步骤：（1 ）制取果汁：苹果切成大块，放在多功能榨汁机打碎，用两层纱布过滤果汁（2 ）配料（以 1L 为例）：向 2L 发酵瓶中加 200g 蔗糖，然后倒入果汁，转动发酵瓶使蔗糖完全溶解，最后倒入酵母悬液（约 1g 干酵母） ，混匀，加盖。（3 ）发酵：3 天后可见气泡，10 天后剧烈的发酵停止，此时即可取出果酒过滤和分装。（4 ）静置：静置 5-6 个月，上清
13、液即为果酒，可用虹吸法取出三、用果酒制作果醋实验原理：（1 ）与制作果醋有关的微生物：醋化醋杆菌如能获得醋化醋杆菌的菌种，可在下列液体培养基中培养繁殖，配方：1L 中含蛋白胨 3g，酵母提取物 5g，甘露醇 25g（2 ）制作原理：醋杆菌在有氧的条件下 才能将乙醇氧化为醋酸。醋杆菌所产生的醋酸可使培养液中醋酸的含量高达 13%。C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O2实验步骤：（1 ）连接发酵装置：在装置的甲瓶中加入 800mL 酒水混合物（用铝箔将上口盖住） 。装盒的乙瓶（发酵瓶）中装入锯末（八分满） ，下口用双孔橡胶塞连接发酵瓶和外界空气及锥形瓶（丙瓶） 。（2 ）加入醋化醋杆
14、菌：将适量 醋化醋杆菌的培养物加在 200mL 酒水混合物中混匀，并将 pH调至 7.0 后倒入乙瓶中，使锯末均匀湿透。（3 ）发酵并检测 pH ：将水族箱通气泵的出气管与乙瓶上塞棉花的玻璃管相连 ,通气.不必太快，发酵 48h,检测 PH,若明显酸性,则进入下一步.（4 ）调节活塞，控制流量：调节甲瓶下口的双通活塞和乙瓶下口的螺旋夹，保持液体流量相同。（5 ）检测 pH，监控发酵情况：每天用 pH 试纸检测流出液的 pH，直至 pH 不在减少，或者甲瓶中的液体全部流入乙瓶时，停止实验。8实验 10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定一、泡菜腌制1有关微生物：泡菜制作时起主要作用的微生物是 假丝酵母
15、和乳酸菌。2泡菜制作原理：在无氧的条件下，微生物利用菜种的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质，其中也有亚硝酸（HNO 2） 。3泡菜制作流程：（1 ）预处理：将菜洗净并切成小块，洗净泡菜坛，并加热水洗内壁。（2 ）加料入坛：将蔬菜、盐水、糖、白酒、调味品等放入坛内。如果希望发酵快些，可以将蔬菜在开水中浸 1min 后入坛，再加一些白酒（抑制杂菌生长） 。（3 ）密封发酵：将坛口用水封好（防止外界空气进入） ，腌制 1 周。 （加入泡菜汁更好，相当于接种已经扩增的发酵菌，减少腌制时间）（4 ）成品。二、亚硝酸盐的定量测定1亚硝酸盐测定原理：在盐酸酸化 条件下，亚硝酸盐与 对氨基
16、苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。2亚硝酸盐的定量测定流程：（1 ）样品处理：泡菜 25g 及少量泡菜汤打成 匀浆过滤，用 氢氧化钠（NaOH）将 pH 调至 8.0，再加入 25ml 硫酸锌至产生白色沉淀，水浴加热至 60C，过滤取滤液 定容至 500ml。（2 ）测定：10ml 样品溶液，加入 4.5ml 氯化铵缓冲液、 2.5ml 60%乙酸溶液和 5ml 显色液，定容至 25ml，暗处静置 25min，用光程为 1cm 的比色杯在 550nm 处测定光密度值。 （
17、以 10ml 水为空白对照）（3 ）标准曲线的绘制：取 0、0.5、1.0 、3.0、5.0ml 亚硝酸钠标准溶液，分别放在 25ml 定量瓶中，各加入 4.5ml 氯化铵缓冲液、 2.5ml 60%乙酸溶液和 5ml 显色液，定容至 25ml，暗处静置25min，用光程为 1cm 的比色杯在 550nm 处测定光密度值。以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值（OD 值）为纵坐标，绘标准曲线。9（4 ）计算： X1= m21000 V1 / m1 1000 V2 式中：X 1样品中亚硝酸盐含量 单位：mg/kgm1样品中亚硝酸的含量 单位：gm2标准曲线中亚硝酸盐含量 单位：ug V1 样品处理液
18、总体积。 V2 测定用的样品处理液体积。 实验 11 植物的组织培养一、植物组织培养1概念：取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在无菌条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。2培养基中加入的激素（1 ）激素的种类：生长素和细胞分裂素（2 ）激素的使用比例比例 结果细胞分裂素/生长素比例 高 诱导芽的生成（从状苗）细胞分裂素/生长素比例 相当 愈伤组织继续生长不分化细胞分裂素/生长素比例 低 趋于长根3实验中使用的激素：人工合成的萘乙酸（NAA）代替 生长素人工合成的苄基腺嘌呤（BA）代替细胞分裂素二、菊花的组织培养材料：1.MS
19、 培养基:由大量元素、微量元素和有机成分组成（用于配置发芽和生根培养基）2.萘乙酸（NAA）用少量 0.1mol/L NaOH 溶液溶解苄基腺嘌呤（BA）用少量 0.1mol/L HCl 溶液溶解3.发芽培养基：MS 培养基+苄基腺嘌呤（BA）+萘乙酸（NAA）+蔗糖+琼脂+ 蒸馏水104.生根培养基：MS 培养基+萘乙酸（NAA）+蔗糖+ 琼脂+蒸馏水步骤：1取外植体：超净台上将无菌幼苗切段，每段至少 1 张叶片。2生芽培养：在酒精灯旁，将每段放入一瓶生芽培养基中，使茎的一部分插入培养基内，盖上封口膜。每瓶也可放入 2-3 段幼茎切段，在日光灯下保持 18-25C 的温度培养，每天光照不少于 14.5h。3生根培养：23 周后, 将丛状苗在无菌条件下转入生根培养基 中,在上述条件下继续培养。4适应锻炼：待生根后，将苗转移至草炭土或蛭石中,用玻璃罩或塑料布保持 80以上的湿度,23 天后打开玻璃罩逐渐降低湿度进行锻炼, 直到将罩全部打开处于自然湿度下为止5定植：将苗转移到土中培养。6自然生长的茎进行组织培养方法：取一段茎在 70乙醇中浸泡 10 分钟 5次氯酸钠 溶液中浸泡 5min 5次氯酸钠溶液中浸泡 5min 超净台上用无菌水清洗 将茎移至生芽培养基中
