1、1,多位点可变数目串联重复序列（MLVA）分型技术和操作步骤,李 伟中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-19,2,病原菌分子分型的目的,长期研究病原菌的遗传进化 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异 短期研究 了解病原菌的适应性 感染溯源,3,分子分型方法,序列或分类资料为基础的等位基因： 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repe
2、at Analysis,MLVA）图像分析： 脉冲场凝胶电泳（PFGE) 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 核糖体分型（ribotyping）等,4,MLST,结果无偏性unambiguous results 有相应的数据库支持 international databases区分度低，Low discrimination power 高花费，high cost: sequencing 不适合常规检测和暴发调查，
3、unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies,5,VNTR,VNTR：可变数目出那里重复序列，Variable Number of Tandem Repeats,AACTTTACGTTC,AAATTAACGTTC,AAATTAACGTTC,AAATTTACCTTG,侧 翼 序 列,重复单元,6,18bp*3,AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA,VNTR产
4、生的原因：聚合酶的滑链复制,7,Strain CDC1551: 5 x 15 bp,Strain H37Rv: 4 x 15 bp,strain CDC1551 : 230 bp,strain H37Rv : 215 bp,PCR primers: CTCCCACACCCAGGACAC CGGCCTACCCAACATTCC,TRF 软件（Tandem Repeats Finder software），:/minisatellites.u-psud.fr/,VNTR 位点的确定,测序分析,8,VNTR和等位基因,atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
5、,Primer-F,上游序列,VNTR 重复,下游序列,重复拷贝数 =,扩增大小-上下游序列,重复单元的大小,Primer-R,取整：就近取整或去除小数取整,9,串联重复序列可变重复数目的判定,10,MLVA方法,多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：,MLVA1型 735 2 6 6 2 10 2 3 3 1 36 ST1 + + -,MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST 其他特征,MLVA14 1046 15 3 1.7 1 9 1 2 3 0 26 ST
6、81 - - -,11,分析软件：BioNumerics,命名MLVA型：MT1-MT85评价各位点的分辨力： Neis index = 1- (allele frequency)2评价MLVA方法的分辨力： Simpsons index = 1 - nj (nj-1)/N (N-1)聚类分析构建最小生成树,12,MLVA 实验操作,一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板二、PCR 扩增多重PCR反应三、扩增条带大小判断：（一）毛细管电泳：1.引物标记2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）（二）普通电
7、泳分析（三）测序分析,13,MLVA实验步骤-PCR,2个PCR体系/多重PCR体系：,模板制备： DNA提取模板 水煮模板,14,扩增条带大小判断：,（一）毛细管电泳：1.引物标记2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带） （二）普通电泳分析 （三）测序分析,15,用500liz内标标定扩增片段大小用genemap软件分析毛细管电泳图,用毛细管电泳来判断片段大小,16,MLVA聚类分析,Bionumerics 软件（version 4.64 ）效用均等的分类资料的分析方法（ UPGMA） (unweig
8、hted pair group method using arithmetic averages) 等分权重分类图/最小生成树的形式展现 多态性指数： Simpsons index,17,MLVA方法的应用,Neisseria meningitidis(23)Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12),Salmonella Enteritidis(10),Salmonella enterica(5,35),Listeria monocytogenes(28,29,39),Legionella pneumophila(33), C
9、lostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38),Escherichia coli O157:H7(30,46),Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42),Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al,18,分型方法评价标准,区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流
10、行病学相关性（epidemiological concordance）方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret） 花费 技术难度,19,MLVA方法的好处,上述的优点具有弹性 flexibility. 不需要参考菌株作为参照,20,第二部分,发展一种新的MLVA方法,21,基于序列的比较初筛,多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选,核酸测序 确定重复模式,区分效能评价,系统测试筛选多态性VNTR,得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点,现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪
11、链球菌2型 36个电泳行为不同,确认重复序列和重复单元数 14个确定指标,9个指标的MLVA策略,22,TRF 软件 （Tandem Repeats Finder software）:/minisatellites.u-psud.fr/,串联重复的鉴定,匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分以猪链球菌为例： 鉴定了750,749,790,784 测序菌株基因组串联重复位点的比较,23,串联重复的鉴定,24,串联重复的鉴定,25,串联重复的鉴定,26,27,inserted a small segment,28,29,多种重复模式,TR2,30,第三部分,MLVA方法在猪链
12、球菌分型中的应用,31,猪链球菌暴发疫情,2005年-四川人感染猪链球菌暴发疫情 215人感染、39人死亡 波及四川36个县的202个村庄 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例江苏 1998暴发疫情 25 感染/14 死亡,Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China.Emerg.Infect.Dis. 12:914-920,32,中国猪链球菌PFGE型别,SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 2005，2006年和2007年中国ST7菌株：PFGE-01型,
13、Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.,33,猪链球菌MLVA指标和特征,上游引物标记： FAM / HEX/ TAMRA. 多重PCRs M1和M2用毛细管电泳 M3用普通电泳法,TR18 低或中等变异度指标 TR9 高变异度指标 (value 0.96).,34,指标的等位基因型,35,166 株 猪链球菌血清2型 的MLVA分型,36,37,38,2005年江西猪链疫情的分析,冷库的搬运工： JX1 冷库猪肉： Jxs1，Jxs2 ，Jxs3 共同的型别MLVA31. 江西病猪来源于江苏1998年的三株江苏菌株和2005年的江苏菌株也为MLVA31型。,39
14、,输入性人感染猪链球菌分析,2009年4月， 泰国籍。 我们实验室鉴定，分离菌株（W2886） 血清2型， ST1型。,40,Cluster I,Cluster II,猪链球菌 血清二型 种群关系,41,中国流行株型别特征,流行株： B组 MLST7 PFGE-SmaI 01在中国，ST1型属于散发菌株,MRP+ SLY+ EF-,MRP+ SLY+ EF+,MRP+ SLY+ EF+,MRP- SLY- EF-,42,分型可以判定强毒株和弱毒株,43,MLVA分型方法的应用范围,MLVA方法适合猪链球菌大范围的监测。 暴发调查： 感染来源和追踪感染途径 研究猪链球菌的种群关系,44,合作与进步,45,志贺菌种群聚类（有根树）,46,福氏志贺菌Fxb按分离省份的MST树,47,痢疾志贺菌的MLVA分型尝试,48,鲍氏志贺菌的15个指标的分型尝试,
