1、blast验证引物,一、概述BLAST是Basic Local Alignment Search Tool的英文缩写，意即碱基局部对准检索工具，是一种序列类似性检索工具。它采用统计学记分系统，能将真正配对的序列同随机产生的干扰序列区别开来；同时采用启发式算法系统，即采用的是局部对准算法(Local Alignment Algorithm)，而不是全序列对准算法(Global Alignment Algorithm)。,进入网页： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi,常见生物基因组的blast,蛋白质序列数据库,核酸序列数据库查询；,先将待查询的
2、核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询；,先将核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列， 然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询；,先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询。,特殊blast,Blast的页面,引物序列输入窗口,ATGTTGGGGAAATGCTTGACC,数据库的选择,在此，我们选择 第三个数据库,程序的选择,显示结果在新的窗口,点击此按钮，进入结果页面,输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的
3、blast程序。在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列之后看两者的交叉。,等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。 该网页用三种形式来显示blast的结果。,（1）图形格式,通过点击相应的bar 可以得到匹配情况的 详细信息。,（2）结果信息概要：,从左到右分别为： A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息 B、系列的简单描述 C、高比值片段对（high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式匹配的碱基20.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1
4、。 D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了 E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：U代表：Unigene数据库 E代表：GEO profiles数据库 G代表：Gene数据库,A,B,C,D,E,（3）结果详细信息,序列的信息,上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况： 共有21个碱基匹配，得分42.1分【2120.142.1】，E值为0.014 上游引物与序列的121位点匹配,结果判断： 验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用 检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。,
