1、辽宁博鳌生物制药有限公司 GMP 文件注射用水微生物限度检查标准操作规程颁发部门 质量部 操作标准 编号 版本 00起草人 户婷婷 审核人 关欣 批准人 唐治华起草时间 2013 年 03 月 15日 审核时间 2013 年 03 月 20日 批准时间 2013 年 03 月 25日生效日期 2013 年 03 月 26 日发送部门 质量部、实验室 页码 第 1 页 共 3 页目 的：建立注射用水微生物限度检查的标准操作规程，保证化验结果的准确、可靠。范 围：本标准适用于注射用水的微生物限度检查。依 据：中国药典2010 年版二部。 职 责：QC 检验员对本标准的实施负责。正 文：1 简介微生
2、物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。本方法采用薄膜过滤法。2 环境要求微生物限度检查应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 的现行国家标准进行洁净度验证。3 人员要求无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。4 仪器垂直层流超净工作台、微生物限度检查仪、恒温培养箱、显微镜、高压灭
3、菌锅、镊子、75酒精棉球。5 样品处理以无菌操作方法取注射用水 500ml，混匀，备用。6 实验前准备6.1 培养基、冲洗液制备方法6.1.1 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基 32g，加 1L 纯化水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装，121高压灭菌 20min。取已灭菌的平皿，以无菌操作法将已灭菌完成的培编号 SOP-XX-XX-001-00 类别 操作标准部门 质量部 注射用水微生物限度检查标准操作规程 页码 第 2 页，共 3页养基以每皿约 10ml 的装量分装，待培养基凝固后移出洁净区。每批选 3 支培养基放入30-35恒温培养箱中作对照培养，培养 3 天，应无菌生长。 制备好的培养基
4、平皿应在2-8的环境中存放。6.1.2 玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基 30.5g，加 1L 纯化水，加热溶解，分装，121高压灭菌 20min。以无菌操作法将已灭菌完成的培养基以每皿约 10ml 的装量分装，待培养基凝固后移出洁净区。每批选 3 支培养基放入 23-28恒温培养箱中作对照培养，培养 5 天，应无菌生长。制备好的培养基平皿应在 2-8的环境中存放。6.1.3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：取酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 50g，加 1L纯化水，加热溶解，分装，121高压灭菌 20min。 以无菌操作法将已灭菌完成的培养基以每皿约 10ml 的装量分装，待培养基凝固后移
5、出洁净区。每批选 3 支培养基放入23-28恒温培养箱中作对照培养，培养 5 天，应无菌生长。 制备好的培养基平皿应在2-8的环境中存放。6.1.4 pH7.0 氯 化 钠 蛋 白 胨 缓 冲 液 ： 取 磷 酸 二 氢 钾 3.56g、 磷 酸 氢 二 钠 7.23g、 氯 化 钠4.30g、 蛋 白 胨 1.0g， 加 水 1000ml， 微 温 溶 解 ， 滤 清 ， 121高压灭 菌 20min。6.2 用具的洗刷6.2.1 玻璃器皿：如试管、三角瓶等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用纯化水洗涤 45次，倒置，晾干。试管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。6.2.2 剪刀
6、、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用纯化水洗涤 3 次。6.2.3 洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。6.3 用具的包扎及灭菌6.3.1 洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。6.3.2 试管口塞上胶塞、三角瓶等用 8 层纱布将瓶口扎紧。6.3.3 一次性使用枪头用报纸包起来。6.3.4 将洁净服等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。6.3.5 将以上包扎好的用具在 121高压灭菌 20 分钟。物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌。 6.4 洁净室的清洁与灭菌6.4.1 洁净室及
7、超净台，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。6.4.2 在每次操作前，应做好清洁工作，并用 0.2%新洁尔灭溶液或 2%来苏尔或 75乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌 30min，超净台空气过滤器自净 30min。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面。编号 SOP-XX-XX-001-00 类别 操作标准部门 质量部 注射用水微生物限度检查标准操作规程 页码 第 3 页，共 3页7 操作 开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。操作人员按进入洁净室更衣标准操作规程洗手、更衣（衣、裤、帽、口罩） 、换工作鞋，通过进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭
8、内侧门，将物品放置于实验台上。工作结束后，将实验用具放入传递窗内，人员经缓冲间离开洁净室，取出传递窗内的实验用具并处理。7.1 微生物限度检查以无菌操作，取注射用水 100ml。将少量 pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液注入微生物限度检查过滤器中，润湿滤膜，取已制备好的注射用水水样 100ml 注入滤器，再用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，使总冲洗量为 200ml，待滤膜抽至近干，取出滤膜，菌面朝上贴于已制备好的营养琼脂培养基上,30-35培养 3 天。同法制得另两张滤膜，菌面朝上贴于已制备好的玫瑰红钠琼脂培养基及酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上，23-28培养 5 天.阴性对照实验：取 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照，阴性对照不得有菌生长。7.2 培养与计数7.2.1 营养琼脂培养基在 3035培养 3 天，玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基在 2328培养 5 天。培养期间应逐日检查菌落生长情况，并填写微生物限度检查记录。必要时，用 5-10 倍放大镜检查，是否遗漏。7.2.2 若培养皿上有 2 个或 2 个以上菌落重叠，可分辨时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。7.3 结果判断每 100ml 注射用水中细菌、霉菌、酵母菌总数不得超过 10cfu。
