1、 纯化水微生物限度检查法验证方案1. 验证目的：纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。确认该方法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。2.职责2.1 验证委员会：负责验证方案及报告的批准并组织协调验证工作并签发验证证书。2.2.验证组长2.2.1.负责验证方案的起草2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案的顺利实施。2.2.3.负责验证报告的审批。2.2.4.负责发放验证证书。2.2.5.负责再验证周期的确认。23. 质保部23.1.负责验证方案审核23.2.负责取样及对样品的检验23.3.负责收集验证记录，并加以分析后，起草验证报告。23.4.负责验证数据及结果的审核按照我们现在现
2、有的验证方案进行修改3. 参照标准：2010 版中国药典二部附录 XI J 微生物限度检查法。4. 验证项目：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。5. 合格标准：试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于 70%。6. 试验材料：6.1. 被验证产品：品名 纯化水 取样点 总出水口 总回水口 R502（管道最后一个出水口） 检验量 5ml 6.2. 仪器设备：6.2.1. SYQ/ZDX-35B1 型自动座式压力蒸汽灭菌器 6.2.2. YOKO-ZX 紫外分析暗箱 6.2.3. SW-EJ-2FB 双人净化工作台 6.2.4. 101-2A 电热鼓风干燥箱 6.2.5.SPX-250B
3、 型生化培养箱 (2328)6.2.6.PHW-200S 恒温培养箱(3537)6.2.7.CR-505065 数显隔水式恒温培养箱(3035)按照我们的仪器设备修改参数6.3. 稀释剂： 0.9%无菌氯化钠溶液6.4. 验证用培养基 名称 生产厂家 批号营养琼脂培养基营养肉汤培养基玫瑰红钠琼脂培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂培养基到研发寻找培养基，填上生产厂家和批号6.5. 验证用菌株：(第 3 代)7. 菌液制备 7.1. 取经 3536培养 1824 小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物 1ml 加入到 9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10 倍稀释至 10-
4、610-7 约为50100cfuml 的菌悬液备用。7.2.取经 2425培养 2448 小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物 1ml 加入到 9ml0.9%无验证菌株 培养基 培养温度 培养时间（小时）大肠埃希菌 营养肉汤 3035金黄色葡萄球菌 营养肉汤 3035枯草芽孢杆菌 营养肉汤 3035白色念珠菌 改良马丁培养基 2328黑曲霉菌 改良马丁琼脂培养基 2328菌氯化钠溶液中，10 倍稀释至 10-5 约为 50100cfuml 的菌悬液备用。7.3.取经 2425培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加 0.9%无菌氯化钠溶液 10ml 将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热
5、灭菌）过滤，除去菌丝，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液，取此孢子悬液 0.1ml 加到 9.9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，稀释至 10-5 约为 50100cfuml 的菌悬液备用。8.菌液计数：（每种菌液接种 2 个平皿）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别划线接种至营养琼脂培养基，置3536培养二天；白色念珠菌、黑曲霉分别划线接种至玫瑰红钠琼脂培养基，置2425培养三天。菌落计数结果（2 个平皿计数取平均值）见下表菌落计数结果（cfuml）10-5 稀释 10-6 稀释 10-7 稀释试验次数1 2 3 1 2 3 1 2 3大肠埃希菌 87.5 85金黄色葡萄球菌 107
6、.5111.5枯草芽孢杆菌 92.5 99.5白色念珠菌 76 79黑曲霉 51 509.验证方法： 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。9.1.验证日期 9. 2.供试品名称及取样点： 纯化水 取样点 总出水口 总回水口 R502（管道最后一个出水口） 9.3. 供试品制备方法建立: 2010 版中国药典规定纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。但没规定取样量，由于所使用的滤膜孔径不大于 0.45um ，直径为 50mm， 规定每片滤膜上的菌落数应不超过 100 个。如果取样量过大，样品含菌量较多，就会造成细菌不宜分散，点计
7、困难； 如果取样量过少，不能有效反映样品染菌量。为此参照注射用水微生物限度检查法建立以下几种方法进行了筛选试验:方法 1: 每张滤膜取 100ml 样品做为供试液直接过滤。方法 2: 每张滤膜取样品 30ml 用灭菌 0.9%氯化钠溶液 70ml 稀释后作为供试液(100ml)直接过滤。方法 3: 每张滤膜取样品 10ml 用灭菌 0.9%氯化钠溶液 90ml 稀释后作为供试液(100ml)直接过滤。方法 4: 每张滤膜取样品 5ml 用灭菌 0.9%氯化钠溶液 95ml 稀释后作为供试液(100ml) 直接过滤。验证试验采用方法 4 制备供试液，其它筛选试验另外报告。9.3.1.试验组 取供
8、试液 100ml 和 50100cfu 试验菌，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数，每片滤膜上的菌落数应不超过 100 个。9.3.2.菌液组 取 50100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数。 9.3.3. 供试品对照组 取供试液 100ml，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。细菌、霉菌及酵母菌各制备 2 个平皿，测定供试品本底菌数。9.3.4. 稀释剂对照组 取 0.9%无菌氯化钠溶液 100ml 和 50100cfu
9、 试验菌，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数, 每片滤膜上的菌落数应不超过 100 个。9.4. 结果见表独立试验一 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 总出水口 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株 平皿号试验组个5ml（回收率% ）菌液组个ml供试品对照组个5ml稀释剂对照组个 5ml（回收率% ）1 65 83 1 622 62 92 2 74大肠埃希菌(培养 48 小时计数) 平均值 63.5（ 70.9%）87.5 1.5 68（77.7% ）1 82 110 1 752 72 105 2
10、 76金黄色葡萄球菌(培养 48 小时计数)平均值 77（70.2%） 107.5 1.5 75.5（70.2%）1 65 98 1 682 68 87 2 79枯草芽孢杆菌(培养 48 小时计数) 平均值 66.5（ 70.3%）92.5 1.5 73.5（79.5%）1 54 76 2 542 60 76 2 56白色念珠菌(培养 72 小时开始计数) 平均值 57（72.4%） 76 2 55（72.4% ）1 51 53 2 492 50 49 2 54黑曲霉(培养 72 小时开始计数) 平均值 50.5（ 95.1%）51 2 51.5（100.9%）备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母
11、菌培养 72 小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养 72 小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养 96 小时后计数为准。试验周期为 4 天。结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于 70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人 试验人 独立试验二 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 洗瓶用水 试验时间 年 月日 完成时间 年月日验证菌株平皿号试验组个5ml（回收率% ）菌液组个ml供试品对照组个5ml稀释剂对照组个 5ml（回收率% ）12大肠埃希菌(培养 48 小时计数) 平均值12金黄色葡萄球菌(培养 48 小时计数)平均值1
12、2枯草芽孢杆菌(培养 48 小时计数) 平均值12白色念珠菌(培养 72 小时开始计数) 平均值12黑曲霉(培养 72 小时开始计数) 平均值备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母菌培养 72 小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养 72 小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养 96 小时后计数为准。试验周期为 4 天。结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于 70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人 试验人 独立试验三 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 洗涤消毒 试验时间 年 月日 完成时间 年月日验证菌株 平皿号试验组个5ml（
13、回收率% ）菌液组个ml供试品对照组个5ml稀释剂对照组个 5ml（回收率% ）12大肠埃希菌(培养 48 小时计数) 平均值12金黄色葡萄球菌(培养 48 小时计数)平均值12枯草芽孢杆菌(培养 48 小时计数) 平均值12白色念珠菌(培养 72 小时开始计数) 平均值12黑曲霉(培养 72 小时开始计数) 平均值备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母菌培养 72 小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养 72 小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养 96 小时后计数为准。试验周期为 4 天。结论通过三次独立试验,证明所采用的供试液制备方法(8.3. 方法 4)及薄膜过滤法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。复核人 试验人 10. 结论根据验证试验结果，纯化水微生物限度检查按照 2010 版中国药典二部附录 XI J 微生物限度检查法检验，细菌、霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法检查。复核人 试验人
