1、常见的几种信号通路（一）2009 年 04 月 08 日 评论(3)|浏览(90) 点击查看原文 1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与 STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶 JAK 和转录因子 STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过 JAK-STAT 信号通路来传
2、导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及 IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶 JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的 JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶 JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase,
3、RTK），而 JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文 Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为 JAK 既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2 结构域的信号分子。JAK 蛋白家族共包括 4 个成员：JAK1、JAK2、JAK3 以及 Tyk2，它们在结构上有 7 个 JAK 同源结构域（JAK homology domain, JH），其中 JH1 结构域为激酶区、JH2 结构域是“假”激酶区、JH6 和 JH7 是受体结合区域。 (3) 转录因子 STAT（signal trans
4、ducer and activator of transcription） STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT 在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现 STAT 家族的六个成员，即 STAT1-STAT6。STAT 蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA 结合区、SH3 结构域、SH2 结构域及 C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是 SH2 结构域，它具有与酪氨酸激酶 Src 的 SH2 结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT
5、信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的 JAK 激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK 激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（docking site），同时含有 SH2 结构域的STAT 蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶 JAK 催化结合在受体上的STAT 蛋白发生磷酸化修饰，活化的 STAT 蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。值得一提的是，一种 JAK 激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞
6、因子的信号通路也可以激活多个 JAK 激酶，但细胞因子对激活的 STAT 分子却具有一定的选择性。例如 IL-4 激活 STAT6，而 IL-12 却特异性激活 STAT4。 2 p53 信号 1) p53 基因的发现 p53 基因是迄今发现与肿瘤相关性最高的基因。1979 年，Lane 和 Crawford 在感染了 SV40 的小鼠细胞内分离获得一个与 SV40 大 T 抗原相互作用的蛋白，因其分子量为 53 kDa，故而取名为 p53（人的基因称为 TP53）3。起初，p53 被误认为是癌基因，直到上个世纪 90 年代，人们才认识到引起肿瘤形成或细胞癌变的 p53 蛋白是 p53 基因的
7、突变产物。野生型 p53 基因是一种重要的抑癌基因，它是细胞生长周期中的负调节因子，在细胞周期调控、DNA 损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中发挥了重要的生物学功能，因而被誉为“细胞卫士”。随着研究的深入，人、猴、鸡、大鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等多种模式动物的 p53 基因也相继被克隆。 其中，人类 TP53 基因定位于染色体 17P13.1，小鼠 p53 基因被定位在 11 号染色体上，并在 14 号染色体上发现无功能的假基因。在这些进化程度迥异的动物中，它们的 p53 基因结构却异常保守，基因全长 16-20kb，都由 11 个外显子和10 个内含子组成。其中第 1 个外显子不编码结构
8、域，外显子 2、4、5、7、8 则分别编码 5 个进化上高度保守的结构域，转录形成约 2.5 kb 的 mRNA。之后，在基因同源性的基础上又陆续发现了 p53 家族的其它成员，分别是 p73 和p63，它们也因各自的分子量而得名，具有和 p53 相似的结构和功能。 2) p53 信号通路 p53 基因受多种信号因子的调控。例如：当细胞中的 DNA 损伤或细胞增殖异常时，p53 基因被激活，导致细胞周期停滞并启动 DNA 修复机制，使损伤的 DNA得以修复。然而，当 DNA 损伤过度而无法被修复时，作为转录因子的 p53 还可进一步激活下游促凋亡基因的转录，诱导细胞凋亡并杀死有 DNA 损伤的
9、细胞。不然，这些 DNA 损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控，有可能最终形成肿瘤。虽然正常状态下 p53 的 mRNA 水平很高，而且有大量蛋白质合成，但 p53 蛋白容易降解，所以正常细胞内 p53 蛋白水平很低。蛋白的泛素化（ubiquitination）修饰是细胞内蛋白代谢过程中的最普通的降解方式，p53蛋白的降解也是通过泛素化来实现的。MDM2 是一种特异性针对 p53 的泛素化 E3连接酶，它可直接与 p53 蛋白结合来促进 p53 蛋白的泛素化降解，并在细胞内p53 蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2 本身也可被 p53 蛋白激活，因此MDM2 是 p53 通路中重要的负反馈调
10、节因子（negative feedback regulator）。3) p53 与肿瘤 p53 基因敲除小鼠虽然可以产生后代，但其生长发育过程中会出现高频率的自发性肿瘤，这提示 p53 蛋白与肿瘤之间存在密切的关系。事实上，目前 TP53 基因是与人类肿瘤的相关性最高的基因，与 50%以上的人类恶性肿瘤有关，而且现正已在超过 51 种人类肿瘤病例中发现 TP53 基因的异常表达和功能失活。TP53 基因突变是其功能失活的主要原因，至今已发现 400 多种 TP53 基因突变类型，其中 147 种与胃肠道肿瘤有关，而最常见的突变方式是点突变。通过分析大量肿瘤病例中的 TP53 突变位点，证实肿瘤
11、中 95.1%的 p53 点突变位点发生在高度保守的 DNA 结合区，尤以第 175、245、248、249、273 和 282 位点的突变率最高。此外，某些点突变改变了 p53 的空间构象，影响了 p53 蛋白与 MDM2和 p300 等蛋白的相互作用。另一些点突变发生在 p53 的核定位信号区，使 p53无法进入细胞核发挥转录激活的功能。不同肿瘤的 TP53 基因突变位点并不一致，例如：结肠癌中 G:CA:T 转换占到 79%；在乳腺癌中，GT 颠换占到 1/4，而这种突变在结肠癌十分少见；淋巴瘤和白血病的 TP53 基因突变方式与结肠癌相似；在肺癌中 G:CT:A 突变最普遍，而食道癌中
12、发生 GT 颠换的频率很高。 目前看来，在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中，p53 是最主要的因素。有人认为 p53 是很好的肿瘤诊断标志物，可以作为癌症早期诊断的重要指标。认识到 p53 基因的重要作用后，全世界数以千计的分子生物学家正在抛开原来的课题转而研究 p53，希望以此作为攻克癌症的突破口。科学家相信，利用 p53 基因发现并治疗癌症的前景非常广阔。除了基因治疗，研究人员正在筛选可以影响 p53 基因上下游调控的小分子化合物。罗氏制药公司开发的一种名为nutlins 的小分子化合物，能够干扰 p53 和 MDM2 之间的调控关系，有望成为一种有效的抗癌药物。 3 NF-B 信号 197
13、5 年，E. A. Carswell 和 L. J. Old 等人发现已接种卡介苗的小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中产生了一种可引起动物肿瘤组织出血坏死的物质，该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株都具有细胞杀伤作用，于是他们将这种物质命名为肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF）。TNF 是迄今发现的抗肿瘤效果最强的细胞因子。1984 年起，欧美国家就开始把 TNF 的基因工程产品应用到癌症临床治疗中，并一度取得轰动的成果，然而最终由于毒副作用严重而被迫终止。九十年代末以来，随着基础研究的深入和基因工程技术的发展，科学家研制出一些高效、低毒的 TNF 变构体，从而重新确立
14、了 TNF 在抗肿瘤中的重要地位，掀开了 TNF 在肿瘤研究和治疗中的新篇章。 1) TNF 简介 TNF 是一种糖蛋白，它以两种形式存在：TNF-a 和 TNF-b。TNF-a 由单核细胞和巨噬细胞产生，它可引起肿瘤组织出血坏死，而脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）是较强的刺激剂。TNF-b 是一种淋巴因子，又称淋巴毒素（lymphotoxin, LT）。抗原或丝裂原均可刺激 T 淋巴细胞分泌 TNF-b，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能。 人的 TNF-a 基因长 2.76 kb，由 4 个外显子和 3 个内含子组成，定位在第六号染色体上。人 TNF-a 前体由 233
15、个氨基酸组成，含有 76 个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后形成 157 个氨基酸的成熟型非糖基化的 TNF-a。通过基因工程方法改造后的 TNF-a 具有更好的生物学活性和抗肿瘤效果。 2) TNF 与 NF-kB 信号通路 TNF-a 与 TNF-b 分子结构相似，所发挥的生物学效应相近。胞外因子 TNF- 以三聚体形式发挥信号转导功能，与 TNF 受体（TNF receptor, TNFR）结合引起受体多聚化，这种多聚化使得 TNF 受体与细胞质中 TRADD 分子发生相互作用。TRADD 招募相应蛋白后介导两条转导通路：一条是通过 TRAF2 和 RIP 分子诱导NF-B 的活化，参与
16、抗凋亡；另一条是通过 FADD 分子导致细胞凋亡。TNFR 只有在蛋白合成受阻的情况下才会诱导凋亡，下面我们将着重介绍由 TNF 激活的NF-kB 信号通路。 NF-kB（nuclear factor-kappa B）是 1986 年从 B 淋巴细胞的细胞核抽提物中找到的转录因子，它能与免疫球蛋白 kappa 轻链基因的增强子 B 序列GGGACTTTCC 特异性结合，促进 轻链基因表达，故而得名。它是真核细胞转录因子 Rel 家族成员之一，广泛存在于各种哺乳动物细胞中。迄今为止，在哺乳动物细胞内共发现 5 种 NF-kB/Rel 家族成员，它们分别是 RelA（即 p65）、RelB、C-R
17、el、p50/NF-kB1（即 p50/RelA）和 p52/NF-kB2。这些成员均有一个约 300 个氨基酸的 Rel 同源结构域（Rel homology domain, RHD）。这个高度保守的结构域介导 Rel 蛋白形成同源或异源二聚体，该结构域也是 NF-kB 与靶基因 DNA 序列的特异性结合区域。 细胞内 NF-kB 的活化过程受到精细调控。通常情况下，在细胞质中的 NF-kB 处于失活状态，与抑制蛋白 IkB（inhibitory protein of NF-kB）结合成三聚体复合物。当出现 TNF-a 信号、炎症因子以及 LPS、紫外线等外界刺激时，细胞因子与细胞膜表面的
18、TNF 受体结合后，TNF 受体发生多聚化并与细胞质中 TRADD分子发生相互作用。TRADD 招募 TRAF（TNFR-associated factor）和激酶RIP（receptor interacting protein），由 RIP 将信号传递给 IKK（IkB kinase）。在 NF-kB 信号通路中 IKK 扮演了非常重要的角色，尽管上游信号路径的不同，但是最终都汇集到 IKK。IKK 由 a、b 和 g 三个亚基组成，作为激酶的 IKK 能使 IkB 的 a 亚基的 Ser32 和 Ser36 残基和 b 亚基的 Ser19 和 Ser23 残基磷酸化。IkB 随即从 p50
19、/p65/IkB 异源三聚体中解离出来，经泛素化修饰后通过蛋白酶体降解。于是，受到 IkB 抑制的 NF-kB 得以暴露其核定位序列（nuclear localization signals, NLS），迅速从细胞质进入细胞核内，与核内 DNA 上的特异序列相结合，从而启动或增强相关基因的转录。 3) NF-kB 信号通路与癌症 NF-kB 具有明显的抑制细胞凋亡的功能，与肿瘤的发生、生长和转移等多个过程密切相关。在人类肿瘤尤其是淋巴系统的恶性肿瘤中，常可发现 NF-kB 家族基因的突变。NF-kB 家族与癌症相关性的第一个线索是 c-Rel 基因的发现，它是禽类逆转录病毒癌基因 v-Rel
20、在细胞内的同源基因。该病毒在鸡体中造成多种造血细胞恶性转化，引起淋巴癌的发生。由于 NF-kB 的下游基因包括CyclinD1 和 c-Myc，因此 NF-kB 的持续激活会刺激细胞生长，导致细胞增殖失控。NF-kB 在很多癌细胞中表达异常，如在 75的乳腺癌样品中 NF-kB2 的表达比邻近的正常组织高很多倍。肿瘤细胞迁移并浸润到周围组织是肿瘤扩散和转移的前提条件。NF-kB 对肿瘤转移具有明显的促进作用，它能促进肿瘤转移相关基因 ICAM-1、VCAM-1、MMP-9 等的表达。NF-kB 还能诱导血管内皮生长因子VEGF 的表达，促进血管形成。此外，NF-kB 还能通过调节 COX2 等
21、基因的表达来促进肿瘤生长。 NF-kB 与肿瘤治疗息息相关。IFN-a、IFN-b、TNF-a、IL-2、G-CSF、GM-CSF 和EPO 是迄今为止被批准用于临床肿瘤治疗的几种细胞因子，其中前 6 种生长因子已被证实与 NF-kB 的信号通路有关。目前，国内外主要以 NF-kB 为靶点，使用抗氧化剂抑制 NF-kB 活性以及针对 p65 和 p50 设计小分子干扰 RNA（siRNA）抑制 NF-kB 合成等方法作为癌症的治疗策略，而且在动物实验及细胞培养中取得不同程度的疗效，但是离临床应用还有很大距离。由于 TNF-a 具有很好的抗肿瘤作用和多种免疫调节功能，许多国家开展了用 TNF 治
22、疗癌症的临床研究。动物实验和临床实验均表明，TNF-a 对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于不能很好地区分癌细胞和正常细胞，使用 TNF-a 后副作用较大，这为其大规模临床应用造成困难。应用基因工程改造得到低毒高效的 TNF-a 变构体，对某些肿瘤的治疗效果尤佳。将 TNF-a 与其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子，如IL-2、IFN-g 等联合使用，既可减少用药量、降低毒副作用，又可提高疗效，因而有望更快地大量应用于临床。 4 Ras、PI(3)K 和 mTOR 信号 1) 控制肿瘤生长的 Ras、PI(3)K 和 mTOR 信号 随着人类基因组测序的完成，目前已发现了几百种蛋白激酶。根据它们
23、结构上的相似性，这些激酶可分为多个蛋白家族，在细胞的增殖、生长、分化和凋亡等过程中发挥重要的生物学功能。Ras、PI(3)K 和 mTOR 就是一类与细胞增殖紧密相关的蛋白激酶。 真核细胞的正常生长受到周围环境所提供的养分的限制。Ras 和 PI(3)K 信号通过调控下游分子 mTOR，在调控细胞生长方面起着关键作用。在绝大多数的人肿瘤细胞中，Ras 和 PI(3)K 信号通路中的关键调控因子都发生了明显的突变。究其原因，人们发现这条信号通路如果发生突变，就会导致细胞的存活和生长不再受到养分等环境条件的限制，进而诱导细胞癌变。 Ras、PI(3)K 和 mTOR 是目前研究得最为清楚的信号通路
24、之一。下面，我们将简单地介绍一下这条信号通路中的几个关键组分： (1) PI(3)K 是英文 phosphatidylinositol-3-kinase（磷脂酰肌醇-3-激酶）的缩写。它是一个包括许多脂质激酶的家族，由一个调节亚基（p85）和一个催化亚基（p110）组成。当配体与膜受体结合后，受体激活 p85 并招募 p110，进而催化膜内表面的 PIP2（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate）生成PI3P（phosphatidylinositol 3-phosphate）。PI3P 作为第二信使，进一步激活 AKT 和 PDK1（phosphoinos
25、itide-dependent kinase 1）。 (2) AKT 又称作 PKB（protein kinase B），是 PI3K 重要的下游分子，包括至少 3 种形式，分别为 AKT1、AKT2 和 AKT3。它们对于调控细胞的生长、增殖、存活以及糖代谢都起着十分重要的作用。 (3) mTOR（mammalian target of rapamycin）是一类丝/苏氨酸激酶。1991 年，人们在酵母中发现了雷帕霉素（rapamycin）的作用靶点，取名为 TOR。与酵母相比，哺乳动物的 TOR 蛋白在进化和功能上高度保守，也就相应地称为mTOR。mTOR 蛋白的 C 末端具有激酶活性，它
26、是细胞生长和增殖的关键调节分子，可接收生长因子、营养、能量等多种信号，并通过 PI3K/AKT 或 Ras/ERK 信号通路来发挥作用，而对 mTOR 信号通路的抑制可以使细胞停滞在 G1 期而触发细胞凋亡。 简单地说，当 EGF、胰岛素等生长因子结合到细胞膜表面的酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK）后，RTK 通过其酪氨酸激酶活性分别激活两个关键的信号转导分子：小 G 蛋白 Ras 和激酶 PI(3)K，再由 Ras 和 PI(3)K共同激活下游关键分子 mTOR。激活后的 mTOR 蛋白促使底物 S6K（S6 kinase）和 4EBP1（4E bi
27、nding protein 1）发生磷酸化。由于这两个底物都是蛋白翻译过程中关键性的调节因子，它们的磷酸化导致核糖体蛋白合成的起始和增加。此外，胞外营养物质氨基酸、ATP 等也能调控 mTOR 的激酶活性。于是，mTOR 蛋白整合生长因子和环境养分两种信号，通过严格调控细胞有丝分裂和代谢响应不同的环境条件，保证细胞只在有利的环境下增殖。 值得注意的是，一些肿瘤抑制因子，如 TSC1、TSC2 和 LKB1 在营养匮乏的条件下减弱了 mTOR 信号通路的强度。相应地，TSC1、TSC2 或者 LKB1 的失活突变，就会导致相似的癌症症状，并具有共同的临床表现。因此，这条确保细胞在环境适宜条件下发
28、生增殖的信号通路，在被癌细胞利用后就可以使癌细胞在养料匮乏的条件下存活并生长。 在筛选激酶抑制剂的过程中，人们设计了一系列针对 mTOR、PI(3)K、RTKs 和Raf 等激酶的药物。在癌症的分子机理研究中，尽管这条信号通路研究得最透彻，但这些激酶在细胞和生物体内的生理功能远比我们想象的要复杂。 2) Ras-Raf 通路与癌症 1982 年，美国科学家 R.A. Weinberg 等人从膀胱癌细胞中克隆得到第一个人类癌基因，由于它和之前发现的鼠肉瘤病毒基因 c-ras 高度同源，故而被命名为ras 基因（rat sarcoma）。Ras 基因在进化中高度保守，广泛存在于各种真核生物细胞中。
29、哺乳动物的 Ras 蛋白家族有三个成员，分别是 H-ras、K-ras 和N-ras。由于 Ras 蛋白的相对分子量是 21 kDa，故又被称为 p21。Ras 蛋白定位于细胞膜内侧，为 GTP/GDP 结合蛋白，通过 GTP 与 GDP 的相互转化来调节信号通路的传递；之后，人们又发现了 Ras 的直接效应因子 Raf-110，这就将 Ras和 ERK/MAPK 信号通路联系起来。在高等生物中，Raf 丝/苏氨酸激酶家族由三个成员组成，分别为 A-raf、B-raf 和 C-raf（也称 Raf-1）。 随着研究的深入，Ras 信号通路构成一个复杂的网络。简单地说，被生长因子激活的酪氨酸激酶
30、受体 RTKs 以直接或间接的方式结合 GRB2（growth factor receptor-bound protein 2）。GRB2 与受体 RTK 结合后招募鸟苷酸交换因子SOS 蛋白定位在与 Ras 相邻的细胞膜上。这样，SOS 与 Ras 形成复合体后，GTP取代 GDP 与 Ras 结合，Ras 被激活；而当 GTP 被水解成 GDP 后，Ras 失活。Ras蛋白被激活后，产生一系列级联放大反应。首先，它招募细胞浆内的 Raf1 蛋白至细胞膜上。之后，Raf 激酶磷酸化 MAPK 激酶（MAPKK，又称 MEK），再由 MEK激活 ERK1/2（extracellular sig
31、nal regulated kinase，又称 MAPK）。ERK被激活后，转至细胞核内并直接激活转录因子，产生相应的生物学效应。需要特别指出的是，Raf 的激活并不完全依赖于 Ras，ERK 也能被除 Ras 之外的其它蛋白激活。这表明信号通路级联反应中的每一个信号蛋白都可能被多个上游蛋白所控制，而它们也可以有多个下游的靶蛋白，从而形成一个极其复杂的网络调控结构。 随着信号通路研究的拓展，人们开始研究 Ras 信号致癌的机理。在超过 60%的人类恶性黑色素瘤中，都发现了 B-raf 的激活突变，这种突变还存在于一些直肠癌以及甲状腺和肺部的肿瘤中。B-raf 突变后，在某些情况下与 C-raf
32、 形成异源二聚体，随后持续地激活下游的 ERK 信号，并最终激活蛋白激酶 mTOR。肿瘤细胞中也存在不涉及 Ras 本身的突变而又持续激活 Ras 的情况。NF1 基因是最早被发现的肿瘤抑制基因之一，它是一个 GAP 蛋白（GTPase-activating protein）。NF1 基因缺失突变后，由于 GTP 水解的减少而导致 GTP 结合形式的Ras 蛋白的积累，从而提高 Ras 的活性。除此之外，降低 miRNA let-7 的表达使靶基因 Ras mRNA 增加，也能提高 Ras 的活性。这里所提到的这些蛋白成分都是未来很好的药物靶点分子。 3) Ras-PI(3)K 信号通路与癌症
33、 早在 20 年前，PI(3)K 信号就被视为一条与病毒癌基因密切相关的信号通路。最近 5 年，人们发现在所有的散发性肿瘤中这条信号通路最常见。在淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、前列腺癌以及其它癌症中这条通路都具异常性。PI(3)K 信号通路可以通过激活 RTK 和 Ras，进而活化下游的靶蛋白mTOR。需要指出的是，丝/苏氨酸蛋白激酶 AKT 家族的很多成员都是 PI(3)K 信号通路在癌症中的重要靶点，例如在 10%20%的胰腺癌、40%的肝癌和 50%的结肠癌中都可以检测到 AKT2 基因的大量表达，这是 PI(3)K 信号通路在癌细胞中异常激活的有力证据。在一些原发性结肠癌
34、和卵巢癌中也检测到 PI(3)K 调控亚基 p85?的突变。这条通路中另一个关键的调节因子是 PTEN（phosphatase and tensin homolog），作为重要的肿瘤抑制基因，它的突变将会导致第二信使PIP3 的大量积累，过度激活下游的 mTOR 通路而使细胞发生癌变。 4) 结语 Ras-Raf 和 Ras-PI(3)K 以及其所激活的 mTOR 信号通路涉及了多个癌基因和抑癌基因的激活和失活，与肿瘤的发生密切相关，日益成为肿瘤研究的热点。这些基础研究将为癌症的治疗提供更多的方案。在过去的几年中，激酶 mTOR 的三种抑制剂，分别是雷帕霉素的类似物 everolimus、de
35、forolimus 和前体temsirolimus 已经进入临床试验阶段。随着这些研究的深入，我们相信会有更多的针对这些信号通路中的分子药物被筛选出来，为最终诊治癌症提供良方。 5 Wnt 信号 Wnt 信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt 信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。1982 年，R. Nusse 和H.E. Varmus 在小鼠乳腺癌细胞中克隆得到第一个 Wnt 基因，最初它被命名为Int1（integra
36、tion 1）。后来的研究发现小鼠 Int 基因与果蝇的无翅基因wg（wingless）为同源基因，因而将两者合称为 Wnt。H.E. Varmus 本人也因他在癌症研究中的杰出贡献而获得 1989 年的诺贝尔生理医学奖。 1) Wnt 信号通路 Wnt 是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用。Wnt 信号通路的主要成分包括：分泌蛋白 Wnt 家族、跨膜受体 Frizzled 家族、CK1、Deshevelled、GSK3、APC、Axin、-Catenin、以及转录因子 TCF/LEF 家族。 Wnt 信号通路是一个复杂的调控网络，目前认为它包括三个分支：经典 Wnt 信号通路，通过
37、 -Catenin 激活基因转录；Wnt/PCP 通路（planner cell polarity pathway），通过小 G 蛋白激活 JNK（c-Jun N-terminal kinase）来调控细胞骨架重排；Wnt/Ca2+通路，通过释放胞内 Ca2+来影响细胞粘连和相关基因表达。 一般提到 Wnt 信号通路主要指的是由 -Catenin 介导的经典 Wnt 信号通路。下面我们将简单介绍一下经典 Wnt 信号通路的主要成分： (1) Frizzled（Fzd 或 Frz）：分泌型糖蛋白 Wnt 的细胞膜上受体，为 7 次跨膜蛋白，结构类似于 G 蛋白偶联型受体。FZD 胞外的 N 端有
38、一个富含半胱氨酸的结构域（cysteine rich domain, CRD），能与 Wnt 结合。 (2)Dishevelled（Dsh 或 Dvl）：Dsh 蛋白在细胞质中接受上游信号，通过抑制APC、Axin 以及 GSK3 等蛋白形成的复合物的功能，稳定细胞质中游离状态的-Catenin 蛋白。细胞质中积累的 -Catenin 蛋白进入细胞核与 TCF/LEF 家族的转录因子结合，从而开启了下游靶基因的转录。 (3)GSK3：是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在没有 Wnt 信号时，GSK3 能将磷酸基团加到 -Catenin N 端的丝氨酸/苏氨酸残基上，磷酸化的 -Catenin经 -
39、TRCP 泛素化共价修饰后，被蛋白酶体（proteasome）降解。 (4) CK1（casein kinase 1，酪蛋白激酶 1）：能将 -Catenin 的 Ser45 位点磷酸化，随后 GSK3 将 -Catenin 的 Thr41、Ser37、Ser33 位点磷酸化。 (5) Axin：是一种支架蛋白，具有多个与其它蛋白作用的位点，能与APC、GSK3、CK1 等形成 -Catenin 降解复合物。此外它还与Dishevelled、PP2A（protein phosphatase 2A）等 wnt 信号的其它组分相互作用。 TCF/ LEF：是一类具有双向调节功能的转录因子，它与 G
40、roucho 结合可以抑制基因转录，而与 -Catenin 结合则促进下游靶基因的转录。 当细胞没有接受 Wnt 信号刺激时，细胞质内大部分的 -Catenin 与细胞膜上Cadherin 蛋白结合使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，参与细胞的黏附作用。而少部分的 -Catenin 被磷酸化后，与 GSK3 等形成降解复合物，最终通过泛素化修饰而降解。Wnt 信号的激活就是指分泌型的配体蛋白 Wnt 与膜表面受体蛋白 FZD 结合后，激活胞内蛋白 DVL。DVL 通过抑制 GSK3 等蛋白形成的-Catenin 降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的 -Catenin 蛋白。胞浆中稳定积累
41、的 -Catenin 进入细胞核后结合 LEF/TCF 转录因子家族，启动下游靶基因（如 c-myc、Cyclin D1 等）的转录。我们可以把 Wnt 信号通路简单概括为：WntFZDDVL-Catenin 降解复合体解散-Catenin 入核TCF/LEF下游基因转录。 2) 经典 Wnt 信号通路与癌症 虽然研究人员很早就发现了 Wnt 信号通路的许多成员，但是直到十年之后，人们才真正将 Wnt 信号通路和癌症联系起来。1993 年，Vogelstein 等人报道肿瘤抑制因子 APC（adenomatous polyposis coli，腺瘤性结肠息肉病蛋白）和 -Catenin 之间存
42、在着相互作用。他们发现大约 85%的人结肠癌中 APC 基因都发生了突变，其缺失突变会导致结肠癌中的腺瘤性息肉。在 Wnt 信号通路中，-Catenin 的稳定性与 APC 蛋白密切相关。APC 蛋白可作为一个载体将 -Catenin 和 GSK3 联系起来，促进 GSK3 磷酸化 -Catenin 氨基端保守的Ser/Thr 位点，并促使 -Catenin 降解。在肿瘤细胞中，APC 基因的突变导致APC 蛋白不能与 -Catenin 相互作用，同时也失去了对 -Catenin 表达水平的调节。-Catenin 在胞浆内大量积聚并进入细胞核，与 TCF/LEF 转录因子结合，激活相关基因的转
43、录，从而导致了细胞增殖异常和肿瘤发生。 -Catenin 本身的突变也可能造成癌症。-Catenin 基因的突变可以造成 -Catenin 蛋白无法被磷酸化和泛素化降解，致使 -Catenin 在胞浆内大量聚集，从而进入细胞核并激活与细胞分裂和生长调控相关的基因（如 c-myc 和 Cyclin D1 等基因），导致细胞增殖失控而致癌。最初，人们只在大约 10%的散发性大肠癌样本中发现了 -Catenin 基因的突变。随后，研究人员检查了超过 3500份的癌症样本，包括结肠癌、黑色素瘤、肝细胞瘤、脊髓母细胞瘤、消化道肿瘤等，发现在超过 700 个癌症病例中出现 -Catenin 的多种突变。-
44、Catenin的 N 端序列可能是其致癌的关键位点，这些位点的突变使得 -Catenin 在胞内表达失控，导致 Wnt 信号异常激活，从而诱发包括结直肠癌、肝母细胞瘤、卵巢癌和前列腺癌等在内的多种癌症。 目前看来，超过 90%的结肠癌以及很高比例的其它癌症均与 Wnt 信号通路的异常激活密切相关，而且细胞实验也证明如果阻断 Wnt 信号通路可以抑制肿瘤细胞的增殖。因此，人们开始尝试把 Wnt/-Catenin 信号通路中的关键蛋白作为药物靶点，筛选分子药物治疗癌症。目前，已有多种分子靶向药物进入临床试验阶段。然而癌症的发生是一个多因素、多阶段、多基因变异积累的复杂过程，多种信号通路可能同时参与
45、了癌症的发生。随着未来研究的深入，我们期待更多 Wnt 信号通路新成员的发现。细胞内信号通路相互协同机制的研究，能够为我们设计更加有效的抗癌药物提供更多的理论基础。 6 BMP 信号 1) BMP 信号通路 BMP（骨形态发生蛋白，bone morphogenetic protein）是 TGF-（转化生长因子，transforming growth factor-）超家族中的重要成员。它通过调节一系列下游基因的活性，控制着诸如中胚层形成、神经系统分化、牙齿和骨骼发育以及癌症发生等许多重要的生物学过程。BMP 信号的传递主要通过配体 BMP与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体（BMP recep
46、tor, BMPR）特异性结合，形成配体受体二元复合物。同时，型受体（BMPR2）能够活化 I 型受体（BMPR1），并进一步将信号传递给细胞内的 Smad 分子。在 BMP 和 TGF- 信号由细胞膜传递至细胞核的过程中，Smad 蛋白起到了关键性的作用。活化的 I 型受体（BMPR1）进一步磷酸化 Smad 蛋白（Smad1、Smad5 和 Smad8），促使 Smad分子从细胞膜受体上脱离下来，并在胞质内结合 Smad4 分子（common Smad，Co-Smad）后进入细胞核。在细胞核内，Smad 多元复合物在其它 DNA 结合蛋白的参与下作用于特异的靶基因，调控靶基因的转录。 2)
47、 结肠中的 BMP 信号 结肠（colon）是大肠的主要部分，它的解剖结构由内向外依次为粘膜层及粘膜下层、肌层及外膜。粘膜和部分粘膜下层向肠腔内的突起为半环形皱襞的断面，凹陷处即称为结肠隐窝（colonic crypt）。结肠隐窝处的细胞类型依次为单层柱状上皮细胞、干细胞、肌成纤维细胞（myofibroblast）和粘膜肌（muscularis mucosae）。结肠中的干细胞位于隐窝底部，不断分裂增殖后形成的子细胞边分化边向内移动，当到达肠腔表面时就分化成为成熟的肠上皮细胞。许多研究证据显示，多种 BMP 信号通路中的关键蛋白都在结肠隐窝的细胞中表达。例如，位于结肠粘膜层的柱状上皮细胞表达
48、BMP 蛋白和 BMP 受体。同时通过免疫组化方法可以在这些细胞中检测到 Smad1、Smad5 和 Smad8 蛋白的磷酸化形式，这表明在分化成熟的柱状上皮细胞中，BMP 信号是被激活的。而肌成纤维细胞和结肠干细胞则通过表达 BMP 信号的拮抗分子 Noggin 来抑制这些细胞内的 BMP 信号，这些结果提示 BMP 信号可能促进成熟的结肠上皮细胞走向凋亡。 3) 结肠癌与 BMP 信号 结肠癌是一种高发病率的恶性肿瘤，在工业化国家里，它是仅次于肺癌的第二大杀手。据美国国立癌症研究院估计，2008 年全美新增结肠癌约 11 万例，死亡约 5 万人。健康成年人体肠道每天大约有 11010 个细
49、胞更新，是人体细胞更新最快的器官。这个更新速度甚至远远超过了肿瘤组织，这反映肠道具有非常卓越和精细的细胞增殖与分化的调控机制，但这种无与伦比的更新速率如同一把“双刃剑”，一方面可以迅速地更新和修复肠粘膜细胞，另一方面却大大增加了肠道细胞因增殖失控而癌变的可能性。近些年来，人们从基因水平、转录水平、蛋白质水平以及细胞信号通路等方面对肿瘤进行了大量的研究，肿瘤的发病机制逐渐被阐明。从分子遗传机制角度看，结肠癌可能是目前研究最为透彻的肿瘤之一。 最初发现 BMP 分子是因为这类蛋白能诱导异位的软骨和骨的形成，但目前由于其在大多数肿瘤，特别是结肠癌中的异常表达而成为研究的新热点。早在十多年前，人们发现结肠癌病例中常有 Smad4 基因的缺失，不过当时这被认为是结肠癌的发生与 TGF- 信号相关，而不是 BMP 信号。幼年性息肉综合症（juvenile polyposis syndrome, JPS）是一种常染色体显性遗传病，多见于儿童和青少年。患者的结肠部位通常有 50-200 个息肉，息肉被大量的基质包围，呈现慢性炎症状态，沿着整个肠管线性分布。JPS 患者很高的结肠癌患病风险，其家族成员中得结肠癌的可能性约为 9%-50%，患胃癌和胰腺癌也有报
