1、9 疾病与人类健康,9.1 反转录病毒9.2 人类免疫缺陷病毒9.3 严重急性呼吸系统综合征9.4 原癌基因与抑癌基因9.5 基因诊断和基因治疗,Chapter 9 Disease and human health,肿瘤与癌症,癌（cancer）：一群不受生长调控而繁殖的细胞，恶性肿瘤。肿瘤（tumor）:局限在自己正常位置，不侵犯其他组织细胞。,癌基因,病毒癌基因（V-oncogene）,细胞转化基因（C-oncogene），原癌基因突变产物,DNA病毒,RNA病毒,反转录病毒（Retrovirus） retruvairs,一组含有反转录酶的RNA病毒,9.1 反转录病毒,一、概述二、分类三
2、、反转录病毒的共同特性四、反转录病毒的复制五、反转录病毒基因组DNA的复制六、反转录病毒基因组DNA的整合七、反转录病毒基因组基因的表达,9.1 反转录病毒,一、概述 逆转录病毒（Retrovirus） 、还原病毒、前病毒等。 1908，丹麦科学家发现。 1910-1911，Rous进行体外实验中证实了此病毒的存在。 1964，Temin提出前病毒假说。 1970， Temin, Baltimore等发现反转录酶。 1975， Temin, Baltimore获得诺贝尔生理学与医学奖。,二、分类,逆转录病毒科(Retroviridae)，正逆转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)，
3、7个属。正逆转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)逆转录病毒属(Alpharetrovirus)逆转录病毒属(Betaretrovirus)逆转录病毒属(Gammaretrovirus)逆转录病毒属(Deltaretrovirus)逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)慢病毒属(Lentivirus) 代表种: HIV-1(Human immunodeficiency virus 1)泡沫逆转录病毒属(Spumavirus) 代表种:黑猩猩泡沫病毒(Chimpanzee foamy virus; CFV),根据致病性分为三类 ：RNA肿瘤病毒亚科 爬虫类：蛇病毒 禽类：
4、Rous肉瘤病毒，禽白血病病毒等 哺乳类：鼠肉瘤病毒，鼠白血病毒，鼠乳腺瘤病毒 猪肉瘤病毒，牛白血病病毒，猪白血病病毒等 灵长类：灵长类肉瘤病毒，猴白血病病毒，狒C型肿瘤病毒等 人：人类嗜T细胞病毒型,型,型 慢病毒亚科 人类免疫缺陷病毒，绵羊肺腺瘤病毒，马传染性贫血病毒等 泡沫病毒亚科 灵长类、猫、牛、人泡沫病毒等,三、反转录病毒的共同特性,有包膜，球形，直径70-200 nm，有刺突核酸为两条相同的 +ssRNA, 6-9kb核心含反转录酶具有3个结构基因：gag、pol、env多个调节基因复制要形成DNA中间体，与宿主细胞染色体整合成前病毒，且可随细胞分裂而进入子代细胞内,逆转录病毒基因
5、组结构简图, 正常的非转化病毒 LTR gag (pro) pol env LTR 长末端重复序列 变异的转化病毒 LTR gag (pro) pol env src,外膜糖蛋白SU和跨膜蛋白TM,基质蛋白，衣壳蛋白，核酸结合蛋白,逆转录酶和整合酶,蛋白酶,病毒癌基因,Src基因表达p60src蛋白，使多个靶蛋白磷酸化，加速癌变,四、反转录病毒的复制,以tRNA为引物合成负链DNA,降解R,U5,五、基因组DNA的复制,负链DNA的合成,位点特异性切刻酶,第一次跳跃,RnaseH，DNA聚合酶,第二次跳跃，正链DNA的合成,整合到染色体DNA整合酶等完成,转反转录病毒基因人？此时的病毒称为原病
6、毒或前病毒,Figure. Retroviral life cycle.,总结：经历9步反应，两次跳跃（1）tRNA引物结合在5 端PB（paired base)位点，在逆转录酶的作用下合成与U5(unique to the 5 end) 和R（direct repeat）区互补DNA的U 5 和R ；（2）由逆转录酶将模板RNA的U5和R区水解；（3）新合成的-DNA链的R 与RNA3端的R配对，逆转录酶转换为以RNA3端为模板，实现第一次跳跃；（4）负链DNA延伸；（5）模板RNA的U3 （unique to the 3end）、R区和polAn被水解，其5 端也被水解；（6）以RNA的3
7、端为引物合成正链DNA的U3-R-U5；（7）引物tRNA被水解；（8） 正、负链DNA在PB位点处配对，逆转录酶以新合成的负链DNA为模板合成和延伸正链DNA，第二次跳跃；（9）负链DNA U3-R-U5 与正链DNA U3-R-U5 解开，负链DNA 重复合成U3-R-U5 ，形成两端长末端重复序列（LTR）,反转录酶的功能,以RNA为模板合成cDNA；以DNA为模板合成DNA；RNaseH活性；位点特异性切刻酶。引物从何而来？tRNA: 自带病毒基因组RNA的3末端（在特定位点切刻）,六、 整合（目前尚不清楚）,线形dsDNA进入细胞核，两端的LTR相连成环形分子，连接处反向重复序列相邻
8、；病毒DNA与细胞DNA均出现参差断裂；在整合酶作用下，病毒DNA与细胞DNA连接，缺口填充，整合完成。特点：整合到细胞DNA中的病毒DNA与线形DNA比，两端总会少2 bp，其余完全相同；病毒DNA与细胞基因组DNA相连的两端序列都是5 TGCA 3 靶点的选择是随机的；,七、原病毒的基因表达,原病毒DNA在宿主细胞核内，以宿主转录机器进行转录，RNA出细胞核，部分RNA作为基因组RNA，部分RNA作为模板进行翻译；病毒LTR序列不仅提供了整合必须的末端，而且提供了转录和转录后加工的信号；如U 3 里有强启动子，有TATA和CCAAT序列；远端还有增强子翻译后的初始蛋白以多蛋白形式，经过酶切
9、产生相关蛋白和酶。,LTR gag (pro) pol env LTR,外膜糖蛋白SU和跨膜蛋白TM,基质蛋白，衣壳蛋白，核酸结合蛋白,逆转录酶和整合酶,蛋白酶,90% gag 多蛋白经酶切成为病毒衣壳蛋白、基质蛋白、核酸结合蛋白,10% gag-pro-pol 多蛋白经酶切成为蛋白酶、逆转录酶、整合酶,Env前体多蛋白经酶切成为病毒外膜蛋白,小结,概念：反转录病毒、前病毒 反转录病毒基因组特点反转录病毒基因组DNA的复制过程反转录病毒复制的特点,5 防治,（1）疫苗：（2）药物：鸡尾酒疗法二脱氧氟硫代胞嘧啶、拉夫米定和阿地福韦的药物组合物 。拉米夫定最早研究时治疗HIV，但报道了HIV合并H
10、BV感染的患者出现HBV亦被抑制的情况。 拉米夫定的这种选择性可能是由于它主要通过与涉及病毒编码的依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的相互作用起效有关。而逆转录酶是HBV和HIV复制所必需的。拉米夫定对艾滋病病毒是有确切疗效的，也是联合国艾滋病规划署、世界卫生组织、中国卫生部指定的几个防治艾滋病药物之一。,3 病毒及其基因组,特点：+RNA无mRNA活性侵染宿主细胞时，逆转录酶、整合酶、引物、基因组RNA都进入多数反转录病毒不裂解宿主细胞，但HIV例外基因组整合到宿主基因组中,2 HIV病毒基因组,属于反转录病毒科，慢病毒属病毒。由两条单股正链RNA病毒，每条RNA基因组约为9.2 kb。在
11、RNA 5端有一帽子结构，3有poly A尾巴。（1）结构基因： HIV基因组中有三个编码结构蛋白和酶的多蛋白基因，分别是gag、pol、env，其中gag和pol使用不同的读码框。,gag 基因约1.5 kb, 编码核心蛋白，其产物与病毒基因组RNA共同组装成核心和衣壳。这些核心蛋白包括p17， p24，p7，p6。pol基因约3.0 kb, 编码病毒复制所需要的各种酶类，与gag 基因重叠，表达时是一蛋白前体p160，在蛋白酶催化下，除形成p17、 p24、p15 和Gag 蛋白外，还有蛋白酶p10， 反转录酶p66/p51，整合酶p32。,env 基因约2.6 kb，编码病毒包膜糖蛋白，
12、先翻译成前体蛋白gp160，被宿主细胞蛋白酶裂解为 gp120和gp41。,（2）调节蛋白基因和辅助蛋白基因 两个编码调节蛋白的基因Tat, Rev 四个辅助蛋白基因 Vpr, Vpu, Nef, Vif，均参与HIV复制。,（3）长末端重复序列HIV基因组RNA两侧有长末端重复序列（LTR），是顺式作用元件区域，如启动子、增强子、转录因子结合位点、调节蛋白Tat的效应元件。,正常结肠粘膜,高增殖结肠上皮,腺瘤,转移癌,APC缺失,DNA去甲基化,k-ras点突变,DCC缺失或点突变,P53缺失或点突变,对结肠癌的研究,早,中,晚,Colorectal cancer (adenomatous
13、polyposis),Normal cell,Hyper-proliferative cell,Early adenoma,Inter-mediate adenoma,Late adenoma,Adeno-carcinoma,Gene,Alteration,Chromosome,5q,loss,APC,12q,Activation,K-RAS,17p,loss,p53,18q,loss,DCC,DNA hypo-methylation,1. Promoter insertion and enhancer insertion (insertion of a retrovirus in the v
14、icinity of the gene),Figure. Regulation of Rb and E2F activities in late G1. Interaction of E2Fs with nonphosphorylated Rb protein initially inhibits E2F activity. When signaling from mitogens is sustained, the resulting initiate the phosphorylation of Rb, converting some E2F to the active form, whi
15、ch activate target genes whose products are essential for S phase.,Figure. Different domains are responsible for each of the activities of p53.,Figure 24-17. Regulation of Src activity and its activation by an oncogenic mutation. (a) Domain structure of c-Src and v-Src. (b) Effect of phosphorylation on c-Src conformation.,
