1、疾病的根本原因：疾病的各种表型的改变是基因 的改变造成的。,一、 基因诊断 (Genetic Diagnosis),基因诊断的基本操作流程包括：核酸抽提 目的序列扩增 分子杂交和信号检测,基因诊断主要是针对DNA分子的遗传分析技术，包含定性和定量两类分析方法。,基因诊断的原理,DNA诊断检测相关基因的结构及其表达功能 特别是RNA产物是否正常。RNA诊断对表达产物mRNA质和量变化的分析。,基因诊断的方法,（1）DNA诊断,斑点杂交等位基因特异寡核苷酸探针(allele apecific oligonucleotide, ASO)PCR/单链构象多态性分析(single strand conf
2、ormation polymorphism, SSCP)限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RLFP),RNA印迹 (Northern blot)是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。RT-PCR,（2）RNA诊断,基因诊断的优点,1、不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2、症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3、产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量,基因诊断的应用,1、遗传疾病2、感染性疾病3、恶性肿瘤4、法医学,1、遗传性
3、疾病的分子诊断,迪谢纳肌营养不良 (Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的隐性遗传性疾病，在25003500个活产男婴中即有一个患者。,致病基因DMD位于Xp21.2-21.3，全长为250kb，有79个外显子。,DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占6070%,检测DMD基因的技术：Southern印迹、多重PCR,多重PCR,在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失,E1 E2 E3,*,*,DMD基因外显子缺失的检测,2、感染性疾病的分子诊断,定性或定量检测致病微生物的
4、核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。,动态、定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据。,SARS相关冠状病毒的分子诊断,检测标本：痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法：1、逆转录-巢式PCR2、逆转录-实时PCR,病人和接触者（具临床症状）的痰液中经PCR检测到了病毒。病人的其它标本经PCR检测到病毒检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。,结 果,疾病的早期即可获得阳性结果（早于血清转换期）。痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅
5、发生于呼吸道。病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。,讨 论,其他感染性疾病的诊断,HBV病毒,HIV病毒,肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变知识增加了个体对肿瘤的易感性，而并不一定马上产生肿瘤。肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程。生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用。,3、肿瘤相关基因的检测,个人辨识亲子鉴定性别鉴定,4、法医学上的应用,定义：基因治疗是指改变以人遗传物质为基础的 生物医学治疗，即通过一定方式
6、将人正常 基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶 细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。对象：体细胞、生殖细胞从基因角度：对缺陷的基因进行修复 将正常有功能的基因置换 增补缺陷基因,二、基因治疗 (Gene Therapy),基因治疗的两种形式,基因治疗的必要条件1、发病机制在DNA水平上已经清楚2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作理想的基因治疗还必须1、外源基因可有效导入靶细胞2、外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3、导入基因能适量表达4、导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害,1、基因置换用正常的基因对基因组中错误（突变）基因在原位进
7、行基因置换或基因矫正，是最理想的治疗策略2、基因增补不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质。3、抑制有害基因表达或过度表达的基因,基因治疗的基本方式,导入的方式,【体外导入（ex vivo）】,体外将基因导入细胞内,达到治疗或预防的目的,使这种带外源基因的细胞在体内表达,再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内,【体内导入（in vivo）】,外源基因直接导入体内有关的组织细胞,使其进入相应的细胞,体内表达,基因治疗的基本程序,治疗靶基因的选择,目前临床试验的治疗基因：合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA目的基因的cDNA的获得cDNA文库中
8、目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法筛选扩增目的基因,载体系统运送基因的工具,1、最好为组织特异性细胞2、细胞较易获得，且生命周期较长3、离体细胞较易受外源基因转化4、离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内， 仍较易成活,基因转移的靶细胞的选择,目前常用的靶细胞有：1、造血细胞 2、皮肤成纤维细胞 3、肝细胞 4、血管内皮细胞 5、淋巴细胞 6、肌肉细胞 7、肿瘤细胞,四、基因治疗,1、基因标记2、单基因疾病3、恶性肿瘤：（1）免疫基因治疗 （2）自杀基因系统 （3）抑癌基因 （4）裂解肿瘤病毒4、病毒性感染5、心血管疾病,腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID),遗传性单基因疾病,治疗基本步骤,ADA基因 + 逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能，改善病人症状,
