1、第八章 核酸化学,第一节.核酸概述第二节.核酸的结构第三节.核酸的物理化学性质第四节.核酸的研究方法,核 酸 的 研 究 方 法,第 四 节,目 录,(P513,了解),一、核酸的分离、提纯和定量测定,（一）、核酸分离纯化原则保持核酸一级结构的完整性；防止核酸的生物降解。要求：尽可能保持其天然状态。 条件温和，防止过酸、过碱。 避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。,（二）、DNA的分离真核生物的染色体DNA与碱性蛋白质结合形成核蛋白（DNP）。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/LNaCl），但不溶于生理盐溶液（0.14mol/LNaCl）。细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L的盐
2、溶液可使DNP纤维沉淀出来。然后用苯酚或氯仿-异戊醇（辛醇）除去蛋白质。（均为变性剂）,（三）、RNA的分离RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更加困难。制备RNA通常需要注意3点：所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙（bei）烤，塑料用品经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase的活性。在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin）。,目前最常用的制备RNA的方法有两个：用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提
3、。异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。RNA的密度大于DNA和蛋白质，沉在底部。此法可制备较大量高纯度的RNA。另外，RNP（RNA蛋白质）易溶于0.14mol/L的盐溶液，根据此特性可以粗略的使DNA和RNA分离。,（四）、核酸含量的测定核酸含量的测定常用的方法有紫外分光光度法、定磷法和定糖法。紫外以讲。（1）定磷法即钼蓝比色法，样品经浓硫酸或过氯酸处理，有机磷焙水解为无机磷，在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝，其最大吸收峰在660n
4、m处，在一定范围内溶液光密度与磷含量成正比，据此可以计算出核酸的含量。（2）定糖法RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与地衣酚（甲基苯二酚）反应呈鲜绿色，最大吸收峰在670nm。DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm。,二、核酸的超速离心（密度梯度离心）,将8.0mol/L的CsCl溶液装入离心管中，DNA样品装在离心杯的顶部，4.5万转以上离心。这时离心杯中将形成线性的CsCl浓度梯度，上小下大同时在离心力的作用下，DNA样品停留在与其密度相同的CsCl密度的位值。,附：密度及沉降特性,密度： RNA双链DNA； 环状DNA 开环、线状DN
5、A 单链DNA 双链DNA 沉降速度： RNA 环状DNA 开环、线状DNA,核酸的性质,三、核酸电泳,琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，将胶在溴化乙锭中染色（0.5g/mL）。溴化乙锭是扁平分子，易插入DNA的碱基对之间。DNA与溴化乙锭结合后，在紫外线照射下可发射橙红色的荧光，此法十分灵敏，1ngDNA即可用此法检出。,最常用：凝胶电泳优点：简单，快速，灵敏，成本低。常用有：琼脂糖凝胶电泳； 聚丙烯酰胺凝胶电泳,三、核酸电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳(P516),常用于分析DNA，用于分析RNA时，由于其常含有RNA酶，必须先加蛋白质变性剂（如甲醛等）处理后才能用于分析,核酸的研究方法,与电泳迁移有
6、关的因素,1 核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。2 胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，常用1凝胶。3 DNA构象：超螺旋最快，线形DNA其次，开环形最慢。4 电流：一般不大于5v/cm。5 碱基组成：有影响，但不大。6 温度：430，常在室温下进行,核酸的研究方法,电泳完毕，将凝胶在溴乙锭溶液中染色（0.5ug/ml)； 溴乙锭为一扁平分子，很容易插入DNA碱基对之间； DNA与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色的可见荧光。0.1ugDNA即可检出。,核酸的研究方法,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳,加入交联剂 其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于1000bp的DNA片断。另外，一般不含RNA酶
7、，所以可以用于RNA分析。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品，经溴乙锭染色后，在紫外光下，发出的荧光很弱，所以，浓度很低的样品不能用此法检测。,核酸的研究方法,核酸的研究方法,核酸的研究方法,核酸的研究方法,DNA样品回收方法,紫外照射下切下所需DNA,切下的胶条放于透析袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳，34小时后，DNA将电泳出来并粘在透析袋内壁上，将电极倒转，通电3060秒，粘在内壁上的DNA会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提12次，水相用乙醇沉淀DNA。这样回收的DNA纯度很高。,核酸的研究方法,核酸的研究方法,四、核酸的核苷酸序列测定,DNA的酶法测序一、DNA测序 DNA的化学法
8、测序 用酶特异切断RNA链二、RNA测序 用化学试剂裂解RNA 逆转录成cDNA,目前多采用双脱氧链终止法（Sanger酶法）和Gilbert的化学降解法,模板,引物,GGC,GGCC,GGCCATC,C,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,ddATP,A,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,G,ddGTP,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,T,ddTTP,五、聚合酶链反应（PCR,P519）,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某
9、一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制；最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR技术,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应
10、条件PCR过程PCR的特点,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR技
11、术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR技术,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,PCR技术,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR技术,国内外生产的几种DNA扩增仪,PCR反应参数,1. 变性：在第一轮循环前,在94下变性
12、5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.
13、实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37-55,1-2min。,3. 延伸：延伸反应通常为72,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度
14、.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:CC0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。,M 3 5,
