1、1 免疫组织化学（免疫组化）技术 利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry） 。其 特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。 第一节 免疫组化的发展史及应用自 1941 年 Coons 及其同事首创免疫组织化
2、学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。如下表免疫组化的发展过程年代 研究者 事件 1941 Coons 实用免疫萤光技术1948 Fagraeus 进一步发展免疫萤光技术1970 Sternberger 抗体酶标技术1974 Taylor 证实组织中浆细胞免疫组化1975 Kohler Milstein单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞） 。1981 Hsu ABC 法1990 至今 SP 法、原位杂交免疫组化技术由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究
3、有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术
4、出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。越来越多的癌基因2 与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。在国外，病理诊断免疫组化开始于 70 年代，80 年代发展至高峰，90 年代已列入病理技术室常规工作。在国内，免疫组化到 90 年代才开始在病理诊断中逐渐普及。第二节 免疫组化的基本原理基本原理：众所周
5、知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组织化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。反之亦然。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫组化主要涉及免疫学和组织化学的有关理论和技术，其中关键在于制备高效的抗体，后者又主要取决于抗原的质量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体
6、等都可用相应的特异性抗体进行检测。在抗体制备上，经历了从抗血清，纯化 IgG 到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。就单克隆抗体而言，它是在 1975 年由 Kohler 和 Milstein 建立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被广泛应用于研究中，它具有更好的特异性，大大地提高了免疫组化的技术水平。显示技术的发展也相当迅猛，早期只是简单的将标记物结合在抗体上，以后则发展到将标记物结合在抗抗体上或与抗体具有特异亲和性的分子上，用于标记的物质有很多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，就可观察到这些标记物发出荧光、酶促
7、反应产生的有色沉淀或高电子密度颗粒，从而观察到抗原抗体复合物所再的部位。由此可见，免疫组化技术以其特异性和灵敏度高等特点，又因其操作比较简便而得以广泛应用。第三节 有关的免疫学理论抗原（antigen）：抗原应具备的条件： 异物性理化性质特异性3 抗原的种类： 免疫原性与免疫反应性完全抗原不完全抗原抗原与机体的亲缘关系异种抗原同种异型抗原自身抗原抗原的化学结构 蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原低分子量物质抗原合成多肽抗原抗原的理化性状颗粒性抗原可溶性抗原抗原的制备：材料的准备和预处理组织的粉碎抗原的提取抗原纯化抗原纯度的检测半抗原的免疫原制备法抗体（antibody） 是机体受抗原刺激后，由 B 淋
8、巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig）,共有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要分布在血清或外分泌物中。抗体的分子结构抗体的理化性质抗体与抗原的特异性结合抗体的种类抗体的抗原性： 同种型抗体同种异型抗体独特型抗体抗体的制备方法：多克隆抗体（血清抗体）指机体接受抗原的主动免疫或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。单克隆抗体是 1975 年由 Kohler 和 Milstein 发明的一种4 新技术。原理是将体外培养的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有
9、浆细胞分泌单一抗体的能力。这种免疫细胞通过纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。这一技术被称为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。 （祥见图解）5 单克隆抗体与多克隆的特性比较见下表:单克隆抗体与多克隆的特性比较特 性 单克隆抗体 多克隆抗体组成特异性亲合力交叉反应 单一类的抗体高，针对单一抗原决定簇不定，较低低多种类抗体的混合物低，针对多个抗原决定簇平均亲和力较高高第四节 免疫组化的基本技术根据标记物（或示踪物）不同可分为以下技术：免疫荧光组化技术免疫酶组化技术亲合免疫组化技术免疫胶体金组化技术免疫铁蛋白技术还有双重和
10、多重标记技术等。不同的免疫组化技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色，对照试验，显微镜观察等步骤。(一)免疫荧光组化技术1. 基本原理根据抗原抗体反应原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光） ，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。2. 分类直接法间接法补体法双重免疫荧光标记法1) 直接法用荧光标记的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体
11、（第一抗体）直接与标本反应（染色） ，以检测标本中相应的抗原。如图6 特点： 操作简单，特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。染色步骤: 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定。 必要时用酶适当消化。 用 PH7.4 PBS 洗 15 分钟。 滴加经适当稀释的荧光抗体，室温或 37孵育箱内孵育3060 分钟。 用 PBS 洗 3 次，5 分钟/次。 用 50%甘油（用 PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观察。2) 间接法 此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与
12、细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合物。如图7 由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如 细胞抗原上每个分子结合 35 个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可结合 35 个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强 3 或 4 倍。特点：特异性强，灵敏度高，应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标记显示。染色步骤： 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。
13、用 PH7.4 PBS 洗 15 分钟。 滴加经适当稀释的未标记一抗，在室温或 37孵育箱内孵育 3060 分钟。 用 PBS 洗 3 次，5 分钟/次。 滴加荧光标记二抗，在室温或 37孵育箱内孵育 3060 分钟。 用 PBS 洗 3 次，5 分钟/次。 用 50%甘油（用 PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观察。3) 补体法大多数抗原抗体复合物都能结合补体。因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37 孵育后，如发生特异抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体补体荧光抗体的复合物。如图8 特点
14、：只需一种荧光抗体，可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。染色步骤：1 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。 用 PH7.4 PBS 洗 15 分钟。 将抗血清 60灭活 20min，并作适当稀释。 将新鲜豚鼠血清（其中含有补体）稀释 10 倍 取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在切片上，将切片置 37孵育箱内孵育 3060 分钟 用 PBS 洗 3 次，5 分钟/次。 滴加经适当稀释的荧光标记抗补体抗体，在室温或 37孵育箱内孵育 30 分钟。 用 PBS 洗 3 次，5 分钟/次。 用 50%甘油（用 PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）
15、封片 荧光显微镜下观察。4）双重免疫荧光标记法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法。将两种荧光抗体（如 抗 A 和抗 B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗 A 抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗 B 抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标记，发红色荧光，可以明确显示两种荧光抗原的定位。9 3对照实验与荧光抗体染色结果判断（1）对照实验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验（新抗体首次使用）时进行以下对照实验。 免疫荧光染色的对照实 自发荧光 组织不经过荧光染色，在紫外光或短光波的
16、照射下，所呈的荧光称自发荧光。一般自发荧光较弱，多呈蓝绿色或蓝白色，容易与特异性荧光相区别。例： 胶原纤维 蓝绿色弹力纤维 蓝绿色软骨组织 黄绿色心肌 黄绿色红细胞 黄色标本自发荧光对照： 标本只加 PBS 或不加 PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光。 （无与特异性荧光对照设置 直接法 间接法 抗补体法标本自发荧光对照 阳性对照 荧光抗体对照 抑制试验 补体对照 10 相似的荧光）阳性对照： 将以知阳性标本用免疫荧光组化技术染色（直接法、间接法、补体法）结果应呈阳性荧光。荧光抗体对照： 除不加一抗外，其他染色步骤相同，染色结果呈阴性荧光。 （即标本只加荧光抗体染色）抑制试验： 在
17、加荧光标记抗体前或同时，加入未标记的相同抗体，染色结果呈阴性或荧光减弱。补体对照： 取新鲜豚鼠血器清 1：10 稀释，先作用标本，洗后再用补体荧光抗体染色，结果呈阴性。（2）特异性染色应具备的条件 染色只限于特异性抗原。 不应被荧光素结合的非免疫血清染色。 用未标记的特异性免疫血清预先处理标本，则特异性染色被抑制；而用未免疫的血清预先处理，则不能抑制特异性染色。 如果将荧光素标记抗体首先用相应的抗原充分吸收，则特异性染色被抑制；而如果使用无关的抗原进行吸收则不能抑制特异性染色。4荧光抗体的制备荧光抗体的制备方法比较复杂，现在已有各种荧光抗体出售，所以，在这我们不讲。但大家要知道荧光色素的一些种
18、类，以便对免疫荧 光染色结果的观察和判断。目前主要常用的荧光色素有：1）异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）呈现黄绿色荧光2）四已基罗达明（terraethylrodemineB200，RB200）呈现明亮橙红色荧光3）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）呈现橙红色4）4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸氏（SITS）呈蓝色荧光5.荧光抗体的保存以 04 或 -20地低保存6荧光显微镜：它是由超高压光源，滤板系统（包括激发光和压制滤板）和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标
19、本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。使用注意事项：1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压11 贡灯 515 分钟，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适合暗室，再开始观察标本。3）防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应带上防护眼睛。4）检查时间每次以 12 小时为宜，超过 90 分钟，超高压贡灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本受紫外线照射 35 分钟后，荧光也明显减弱或退色，所以最多不超过 23 小时。5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应用电扇散热降温，新换灯
20、泡应从开始就记录使用时间，灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。最好是在稍加观察后即显微摄影。 将标本放在聚乙烯塑料袋中 4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。7）载玻片厚度应为 0。81。2 毫米之间，盖玻片厚度在 0。17毫米左右，标本不能太厚，因太厚会使激发光大部分消耗在标本的下部，而物镜观察到的上部不能充分激发，此外细胞重叠会影响结果判断。8）荧光亮度的判断标准：（质量控制和结果解释）“”无或可见微弱自发荧光 “”仅能见明确可见荧光 “”可见明亮的荧光 “”可见耀眼的荧光(二) 免疫酶组织化学技
21、术（免疫酶细胞化学技术）免疫酶组织（细胞）化学是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。1基本原理：先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。 常用标记酶的种类：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP、ALP、AP）酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）目前，用的最多的酶是 HRP，AKP 用于标记酶的要求：1.
22、酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察。2. 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位。3. 获得的酶分子，最好有商品出售。4. 中性 PH 值时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且12 酶的活性越高越好。5. 酶标过程中，酶与抗体连接，不影响二者的活性。6. 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶其中 1.,2.两点最重要。因为并非容易显示的酶均有形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是最常用的一种酶。 酶标抗体的制备及纯化： 略 酶的底物及沉淀颜色：见下表酶 底物 沉淀颜色HRP
23、AKPDAB（3，3-二氨基联苯胺）+ H 2O2AEC（3 氨基-9乙基卡巴唑）+ H 2O2NBT(四氮唑蓝)+5嗅-4 氯3 吲哚-磷酸盐棕色红色蓝色 免疫酶技术与免疫荧光技术不同在于： 可用普通显微镜代替荧光显微镜，易于推广 切片不易退色，可长期保存 阳性细胞定位精确，较易与非特异性反应鉴别，因此判断容易，主观性少 组织结构清晰，可与 HE 切片对照观察 可作免疫电镜超微结构观察2分类：直接法 间接法补体法 免疫酶桥法免疫酶双桥法过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP）双 PAP 法等1）直接法原理：用酶直接标记在特异性一抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗体
24、反应部位，即可在镜下对标本中的抗原进行检测。13 优点：简便，快速，特异。缺点：敏感性差，标记一种抗体只能检测一种抗原，所以应用受限制。染色步骤： 切片按免疫组化常规处理 0.3%H2O2 甲醇。室温 1030 分钟 必要时，如石蜡切片用 0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS 洗 120 正常血清，室温孵育 15 分钟 滴加适当稀释的酶标一抗，室温或 37，孵育 3060 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟 加酶的底物溶液，510 分钟，显微镜下观察，至特异性染色清晰，背景无染色时，终止显色。 苏木素衬染，脱水，透明，封片。）间接法原理：在间接法中先用未标记的特异性一抗与标本中
25、相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（二抗）结合，然后再加酶的底物显示抗原抗体抗抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。14 优缺点：提高了敏感性，而且用一种酶标记一种抗体就可检测多种抗原，因此较直接法使用广，但其较费时，非特异性染色较多。染色方法： 切片按免疫组化常规处理 0.3%H 2O2 甲醇。室温，1030 分钟 必要时，如石蜡切片用 0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS 洗 120 正常血清，室温孵育 15 分钟 滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或 37，孵育 3060 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟 滴加适当稀释的酶标二抗于标本上，室温或 37，孵育30
26、60 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟 加酶的底物溶液，510 分钟，显微镜下观察，至特异性染色清晰，背景无染色时，终止显色。 苏木素衬染，脱水，透明，封片。以上两种方法都是通过化学方法将酶直接标记在抗体上，所以通称为酶标抗体法。）酶桥法在酶标记抗体过程中，酶与抗体的化学反应交联过程可影响酶的活性和抗体的效价，同时产生非特异酶标记抗体，可增加15 非特异性背景染色，为了避免上述缺点，相继发展了酶桥法和PAP 法。它们是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶抗体，通过酶与抗体的特异性结合进行标记，属于非酶标记的抗体酶法。原理：先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗体，然后以二抗为桥梁
27、，将在组织中与抗原结合的一抗与酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经酶的底物显示出抗原的分布。如图 第一抗体（假设来自种属 A）孵育 60 分钟，37 。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个 Fab 段均与组织抗原结合，较牢固，振洗时不易丢失。 切片与第二抗体（桥抗，抗种属 A IgG 抗体）孵育 1 小时 37 。应用过量的桥抗体能保证一个 Fab 段与第一抗体结合，另一个 Fab段游离。 切片与抗酶抗体（来自种属 A）孵育 1 小时 37。因抗酶抗体和第一 抗体均系种属 A IgG ，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的 Fab 能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体结在与组织抗原结
28、合的第一抗体上。 切片与酶（HRP）孵育 30 分钟 ，酶与抗酶抗体结合。 显色优缺点：在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高方法敏感性，又能节省第一抗体的用量。但其最大的缺点是抗酶抗体必须高度纯化。因为抗酶抗体16 中非特异性抗体不能与酶结合，但能与抗酶抗体竞争桥抗体的结合位点，从而减少了抗酶抗体的结合，而大幅度降低呈色能力。另外，抗酶抗体的酶结合是低亲和力的，冲洗时易丢失而降低其敏感性。染色步骤： 切片按免疫组化常规处理 0.3%H 2O2 甲醇。室温，1030 分钟 必要时，如石蜡切片用 0.1%胰蛋白酶消化，3710
29、30分钟，PBS 洗 120 正常血清，室温孵育 15 分钟 滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或 37，孵育 3060 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟 加适当稀释的二抗，37 或室温，孵育 30 分钟 PBS 洗 3 次，每次 510 分钟 加抗酶抗体，室温或 37 ，30 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 10 分钟 加酶溶液，37 ，孵育 30 分钟 酶的底物显色 衬染，脱水，透明，封片。4）PAP 法原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是先将抗酶抗体与酶结合制成酶抗酶复合物（PAP） ，PAP 复合物中的抗酶抗体和第一抗体为同种
30、属动物的 IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将 PAP 复合物连结在第一抗体上。如图17 PAP 复合物：是离体制备的 HRP 抗 HRP 复合物，它的制备方法较多，在这不介绍。PAP 复合物为五边形环状结构，这种结构极为稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了PAP 法的灵敏度，约比免疫荧光法敏感1001000 倍。比酶桥法灵敏 20 倍。优缺点：灵敏度高，PAP 背景染色低，但制备较复杂。染色步骤： 切片按免疫组化常规处理 0.3%H 2O2 甲醇。室温，1030 分钟 必要时，如石蜡切片用 0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS 洗 120 正常血清，室温孵育 15 分钟 滴加适
31、当稀释的特异性一抗于标本上，室温或 37，孵育 3060 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟 加适当稀释的二抗，37 或室温，孵育 30 分钟 PBS 洗 3 次，每次 510 分钟 加 PAP 复合物，室温或 37 ，孵育 30 分钟 PBS 洗 3 次，每次 5 10 分钟 酶的底物显色 衬染，脱水，透明，封片。5） 双 PAP 法：18 原理：在 PAP 法的基础上重复滴加 1 次二抗和 PAP 复合物，结果使抗原抗体复合物上结合比 PAP 法更多的酶分子，从而更进一步增强了敏感性。双 PAP 法连结机理尚不清楚，可能是第一次 PAP 中还留有未完全结合的位点。优缺点：双 PAP
32、法比 PAP 法更敏感，但步骤较多，费时较长，故不常用。（三）免疫胶体金技术1971 年，Faulk 和 Taylor 首先报道应用免疫胶体金技术研究细胞表面抗原的分布，从此开创了免疫组织化学研究的新领域，即免疫金技术（immunogold technique） 。免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌 A 蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内抗原进行定性、定位、甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密
33、度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。1）胶体金的概念：胶体金是指由直径为 1100nm 范围内的金颗粒所组成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。2）胶体金的理化性质颜色：与粒子的大小有关，如 15nm 的胶体金为红色，而 95nm 的胶体金则为蓝色。一般用于免疫组化的胶体金颗粒直径范围在 560nm，均呈红色，但颗粒越小，红色越深。稳定性：胶体金可以在相当的时间内保持其溶胶不变。胶体
34、金的稳定性受多种因素的影响，其中最主要的是电解质，其次还与浓度、温度等有关。电解质：少量的电解质对胶体金的稳定性有促进作用，但过量的电解质常导致稳定性破坏而使胶体金凝聚。胶体金浓度：浓度越高，金颗粒之间的距离越近，容易导致金颗粒的凝聚。温度：一般情况下，温度对胶体金的稳定性影响不大，但长时间加热会使胶体金的稳定性稍有下降。大分子物质：大分子物质对胶体金的稳定性影响比较复杂，在一定条件下，加入大分子物质可以使胶体19 金的稳定性大大加强，对抗某些影响胶体金稳定因素的作用，如高浓度的电解质等。 带电性：胶体金属憎水性胶体，金颗粒周围包围了大量吸附离子所形成的静电层，带负电，可在电场中泳动。3）胶体
35、金的制备：可用多种方法制备胶体金，其中应用最多的是化学还原法。基本原理：是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠，鞣酸和白磷。其中，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，为15150nm，白磷还原制备的金颗粒直径较小，为312nm。4）胶体金探针的制备略5）免疫胶体金染色方法： 免疫金法 免疫金银法免疫金法（immunogold staining，IGS）免疫金法可分为直接法和间接法两种。一般多采用间接法。1、直接法将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色，然后在光镜或电镜下进行观察。这种方法非常简单，但由于一种探针只能研究一种抗原，所以比较受局限。用胶体金标
36、记的单克隆探针，进行双重或多重染色效果比较好。2、间接法是指先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后用金标的二抗与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究。20 染色步骤：（以人肝组织 HbsAg 的定位为例） 石蜡切片、脱蜡至水 1% 胰蛋白酶消化 10 分钟 用双蒸馏水洗 5 分钟2 用 TBS PH8。2 洗 5 分钟2 1% 卵蛋白（EA ）封闭 10 分钟 稀释鼠抗 HBsAg 单克隆抗体，37 12h ,4冰箱过夜 TBS PH8。2 洗 10 分钟2 1%EA 封闭 10 分钟 TBS PH8。2 稀释兔抗鼠金标记抗体 3745 分钟 TBS PH8。2 洗 10
37、分钟2 双蒸馏水洗 5 分钟2 10% 戊二醛，10 分钟 双蒸馏水洗 5 分钟苏木素衬染核，甘油封片结果：在镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有 HBsAg 定位在细胞浆内。免疫金银法（immunogoldsliver staining， IGSS）基本原理：1983 年 Holgate 等人将 IGH 与银显影方法相结合立。通过免疫反应沉淀在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离（Ag ）子还原成银原子（ Ag0） 。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳” ， “银壳”一旦形成本身也具有催化作用，从而使更多银离子21 还原并促使银壳越
38、长越大，最终抗原位置得到清楚放大。染色步骤： 石蜡切片、脱蜡至水 lugol 液，5min 5% 硫代硫酸钠水溶液脱碘 5min 双蒸馏水冲洗干净 TBS PH7.4 洗 5min2 1% 胰蛋白酶消化 10min 用 TBS PH7.4 洗 5min2 1% 卵蛋白（EA ）封闭 10min 稀释鼠抗 HBsAg 单克隆抗体，37 孵育 12h 或4冰箱过夜 TBS PH7.4 洗 5min2 1% 卵蛋白（EA ）封闭 10min TBS PH7.4 稀释兔抗鼠金标记抗体 37 45min TBS PH7.4 洗 5min2 双蒸馏水洗 5min2 物理显影 双蒸馏水洗 5min222 苏
39、木素衬染核 脱水、透明、封片结果： 光镜下见肝细胞胞浆内有膜状或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。kj2.jpg显影液配方：1. 乳酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液 60ml柠檬酸缓冲液 PH3.5 10ml对苯二酚 1g，加双蒸水 20ml 溶解乳酸银水溶液（100mg 加水 10ml）以上四液临用前依次混合、暗处显影2. 硝酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液 60ml柠檬酸缓冲液 PH3.5 10ml对苯二酚 1.7g，加双蒸水 30ml 溶解硝酸银 40mg，溶于蒸馏水 2ml以上四液临用前依次混合、暗处显影6）免疫胶体金技术的特点 胶体金制备简单制备胶体金所需设备和试剂均易
40、得到，制备方法也简单、快速 标记简单抗体等生物大分子很容易通过界面物理吸附作用，与胶体颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于标记过程中不需要经过任何化学反应过程，因此标记后生物大分子的生物学活性仍基本保持不变。 敏感性高电镜下，金颗粒的电子密度高，界限清楚，即使是单个的金颗粒也容易辨别。因此免疫金电镜的检出率远远超过免疫酶组织化学反应产物 DAB，大大提高了免疫组织化学技术在电镜水平的分辨率。光镜下，金颗粒经银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时，其敏感性也高于其他方法。 特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用很小，较少受组织标本背景因素的影响，在抗原抗体检测中显示出高度的特异性。 定位准确23
41、 由于金颗粒电子密度高，特征明显，呈散在颗粒，不存在酶反应扩散等缺陷，因此免疫金技术定位准确。 适应性广胶体金既能用于普通光镜观察，也能用于透射电镜，扫描电镜，荧光显微镜观察。标本能长期保存。 易于双重和多重标记通过控制条件可制备不同直径的胶体金颗粒，将不同直径的胶体金颗粒分别标记不同的抗体和抗原，可以在一张切片上同时区分两种或两种以上抗原或抗体的分布，因而特别适用于电镜水平的双重或多重标（四）亲和免疫组化技术 亲和组织化学（affinity histochemistry）就是利用一些物质之间的高度亲特性，将酶等标记物连接到抗原抗体复合物上，以对体内的抗原（抗体）进行检测。事实上抗原抗体反应本
42、质上也属于亲和组化这一范畴，只是近代免疫组化方法的更新更突出了亲和这一组化技术的特点。 （因为抗原抗体的结合实际上是由于两者之间具有高度的亲和性）具有高度亲和的物质除了抗原抗体，还有植物凝集素糖类，生物素抗生物素，葡萄球菌 A 蛋白IgG，阳离子阴离子，激素受体等。下面以生物素抗生物素为例生物素（维生素 H，biotin）是一种分子量 244Da 小分子维生素。抗生物素（卵白素，avidin）是一种糖蛋白，分子量为 68KDa，由四个亚单位组成。生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时，生物素具有与酶和抗体结合的能力，这样抗生物素分子与多个生物素结合，生物素又可大量结合酶标
43、记物，起到多级放大作用，因而敏感性强。24 举例：ABC 法（生物素 抗生物素过氧化物酶复合技术，avidin-biotin-complex technique）基本原理：利用上述生物素与抗生物素的特性，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化的辣根过氧化物酶，然后与抗生物素按一定比例混合，形成 ABC 复合物，用生物素化的二抗与一抗结合再与 ABC 复合物结合，最后用底物显色。如图优点： 敏感性高ABC 法与 PAP 法比较要高 2040 倍，这是因为生物素与抗生物素间有极强的结合力，抗生物素同生物素结合有四个结合位点，一部分同生物素化的过氧化物酶结合，另一部分同生物素标记的抗
44、体结合。在 ABC 反应中，抗生物素作为桥连接与生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于生物素分子之间，于是形成一个含有三个以上过氧化物酶分子（大于 PAP 复和物）的网络状复合物，敏感性极大提高。 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。染色步骤： 石蜡切片脱蜡至水 PBS 冲洗，5 分钟3 次25 0.3%过氧化氢（H 2O2）甲醇溶液，2030 分钟 PBS 冲洗，5 分钟3 次 1%胰蛋白酶消化 PBS 冲洗，5 分钟3 次 正常血清孵育，30 分钟 滴加第一抗体（特异性抗体） ，孵育 60 分钟 PBS 冲洗，5 分钟3 次 滴加第二抗体，孵育 60 分钟 PBS 冲洗，5 分钟3 次 滴加第三抗体（ABC 复合物） ，孵育 60 分钟 PBS 冲洗，5 分钟3 次 DAB 显色 自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片k j 1 . j p gSP 法：目前广泛使用的亲和免疫组化法是 SP 法（链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连结法） 。基本原理：用链霉菌抗生物素蛋白代替 ABC 复合物中卵白素（抗生物素）即形成 SP 法。链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌培养物中提取的蛋白，它
