1、功能基因研究策略及工具 功能基因研究策略及工具 功能基因研究策略及工具 功能基因研究策略及工具 吉基 吉基 吉 凯 基因 吉 凯 基因 2014 2014 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！常见问题 常见问题 创新性不够。 立题依据不充分。 实验设计不合理。 实验设计不合理。 如何做好预实验。 如何获得一个好基因。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！典型基金精要 典型基金精要 典型基金精要 典型基金精要 A基因通过调控B信号通路 影响C肿瘤的D功能 A基因通过调控B信号通路 影响C肿瘤的D功能A基因通过调控B信号通路 影响C肿瘤的D功能 1.相关性研究:
2、 A -C 组织水平：肿瘤组织样本基因的表达情况 临床水平：基因表达水平与各种临床特点（恶性程度，转移与否，耐药性， 生存率等）的相关性 2. 功能研究: A -D 细胞水平：生长 凋亡 转移 侵润 血管新生 耐药 细胞水平：生长，凋亡，转移，侵润，血管新生，耐药 动物水平：成瘤，转移，药物敏感 3 机制研究:A B 3 . 机制研究 : A - B 分子水平：相互结合，表达调控，翻译后修饰前，降解调控，剪切调控，胞 内定位，激酶信号传导等 3肿瘤基因功能研究流程推进 肿瘤基因功能研究流程推进 肿瘤 第一步：由特定肿瘤找出相关基因 肿瘤 表达检测 基因 常规方法：表达芯片，等 目的 通过筛选
3、找出在肿瘤组织中有表达 和肿瘤的 功能 目的：通过筛选，找出在肿瘤组织中有表达，和肿瘤的 临床特征有相关性的基因 意义 研究的应用性以及临床相关性 功能 意义：研究的应用性以及临床相关性 机制 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！肿瘤基因功能研究流程推进 肿瘤 肿瘤基因功能研究流程推进 第二步 确定候选基因的生物学功能 肿瘤 第二步：确定候选基因的生物学功能 基本逻辑：改变基因状态后检测细胞模型、动物模型 的表型变化 基因 基因操作 基因操作常规方法：过表达，RNAi 功能 功能检测 功能检测方向：增殖凋亡，转移，血管新生等 功能 目标 确定候选肿瘤相关基因的生物学功能 机制
4、 目标：确定候选肿瘤相关基因的生物学功能 意义：研究的重要性 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！肿瘤基因功能研究流程推进 肿瘤 肿瘤基因功能研究流程推进 肿瘤 第三步：确定基因行使功能的分子机制 常规思路 检测 游基因的变化 包括表达修饰等 基因 常规思路：检测下游基因的变化，包括表达修饰等 常用方法：表达芯片，等 功能 目标：找出受目的基因影响的发生改变的下游分子 意义 决定了文章的深入程度 功能 下游分子检测 意义：决定了文章的深入程度 机制 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！不同阶段研究者推进过程解决方案 肿瘤 已确定肿瘤研究方向，手头有组织样 本
5、，但未确定目的基因的研究者 芯片技术 基因 确定单个目的基因 表达芯片获得候 选基因列表 OERNAi 功能检测 高通量筛选 细胞模型 动物模型 功能 已找到基因功能 芯片技术 机制 表达芯片获得下游变化基因列表1 Cell. 2006 Mar 24;124(6):1283-98.HCS筛选优点 1、高通量。基因操 作工具OK的情况下 作工具OK的情况下 ， 20个基因，半个月。 2 只检测基因干预 2 、只检测基因干预 后的细胞，降低实 验背景及信号噪音， 结果更客观可信。 结果更客观可信。 3、直观检测，结果 重复性好。 重复性好。功能基因高通量筛选的基本要素 合适的基因操作工具 过表达慢
6、病毒文库（20000 ） RNAi慢病毒文库（21000 ） 高通量的功能实验方法及分析手段 细胞模型 （300多株 ） 细胞模型 （300多株 ） 高通量功能检测方法文章示例 Cell Vol 117 927939 June 25 2004 Cell, Vol. 117, 927 939, June 25, 2004 Twist a Master Regulator of Morphogenesis Plays an Twist, a Master Regulator of Morphogenesis, Plays an Essential Role in Tumor MetastasisF
7、igure 1. Microarray Analysis Identified Twist to Be Upregulated di h i during the Metastatic ProgFigure 2. Suppression of Twist Expression by Stable siRNA gp p py Does Not Affect the Proliferation of 4T1 Cells In Vitro and In VivoFigure 3. Suppression of Twist Expression Inhibited the Ability of 4T1
8、 Cells to Metastasize from the Mammary Gland to LungFigure 4. Suppression of Twist Expression Reduced the Presence of 4T1 Cells in the Blood CirculationFigure 5 Twist Induces an EMT and Cell Migration Figure 5. Twist Induces an EMT and Cell MigrationFigure 6. Expression of Twist Results in Repressio
9、n of E-Cadherin TranscriptionFigure 7. Expression of Twist in Human Tumor Cell Lines and in Human Breast Carcinomas合作案例：863项目常见问题 常见问题 创新性不够。 寻找到一个疾病新基因（功能）。 立题依据不充分。 实验设计不合理。 前期工作基础，提出问题的依据。 经典的研究思路。 实验设计不合理。 如何做好预实验。 经典的研究思路。 临床相关性实验，功能提示。 如何获得一个好基因。 芯片筛选、HCS功能筛选。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！让我们用心，
10、换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！吉凯基因 已有课题 已有课题 项目评估，方案分析，主线重要实验的完成 无课题，有临床肿瘤方向 1 、从芯片开始，寻找肿瘤方向上功能新基因 2 公司资源 提供肿瘤方向上的功能新基因 2 、公司资源 ，提供肿瘤方向上的功能新基因 j 0930163 800 800- -720 720- -0302 0302科学家并不意味着聪明过人，而仅仅代表他有某一 领域的基础知识 有比较规范的思考方式 有理性 领域的基础知识，有比较规范的思考方式，有理性 客观的态度，能用一些实验（具体的或抽象的实验 模型）检验理论或假说。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换
11、取您的放心！典型 典型Sci Sci文章精要 文章精要 典型 典型Sci Sci文章精要 文章精要 A基因 通过调控B信号通路 影响C肿瘤的D功能 A基因 通过调控B信号通路 影响C肿瘤的D功能功能基因研究流程 功能基因研究流程 提出问题 提出问题 基因 功能 功能 机制 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！吉凯基因简介 新的肿瘤相关的功能 -新的肿瘤相关的功能 基因 -涵盖多种常见肿瘤类 型 -独一无二的产品： GeneCard暨课题库/ 科研种子 快速获得发表SCI论文 -快速获得发表SCI论文 所需的基因和数据 -快速获得国科金申请 所需的前期工作基础 40使用吉凯基因
12、的产品发表的文献 41代表文章技术路线 Nat Med. IF= 27.136 Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95. Zhou L Li F Xu HB Luo CX Wu HY Zhu MM Lu W Ji X Zhou QG Zhu Nat Med. IF= 27.136 Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS wit
13、h PSD-95. Zhou L Li F Xu HB Luo CX Wu HY Zhu MM Lu W Ji X Zhou QG Zhu Zhou L, Li F, Xu HB, Luo CX, Wu HY, Zhu MM, Lu W, Ji X, Zhou QG, Zhu DY. 2010 Dec;16(12):1439-43. Epub 2010 Nov 21. Zhou L, Li F, Xu HB, Luo CX, Wu HY, Zhu MM, Lu W, Ji X, Zhou QG, Zhu DY. 2010 Dec;16(12):1439-43. Epub 2010 Nov 21
14、. 产品/服务 领域 目的细胞 基因名称 后续检测 过表达慢病毒 细胞生物学 皮层神经元细 胞 （原代培养） Human nNOS-N 1-133 Western Blot、 小鼠脑皮层注 射 （原代培养） 1 133 射 42代表文章技术路线 Nat Cell Biol IF= 19 527 Nat Cell Biol IF= 19 527 Nat Cell Biol. IF= 19.527 Cytosolic FoxO1 is essential for the induction of autophagy and tumour suppressor activity. Zh Y Y J
15、Li W Li X Zh H W S W D F J Y Nat Cell Biol. IF= 19.527 Cytosolic FoxO1 is essential for the induction of autophagy and tumour suppressor activity. Zh Y Y J Li W Li X Zh H W S W D F J Y Zhao Y, Yang J, Liao W, Liu X, Zhang H, Wang S, Wang D, Feng J, Yu L, Zhu WG. 2010 Jul;12(7):665-75. Epub 2010 Jun
16、13. Zhao Y, Yang J, Liao W, Liu X, Zhang H, Wang S, Wang D, Feng J, Yu L, Zhu WG. 2010 Jul;12(7):665-75. Epub 2010 Jun 13. 产品/服务 领域 目的细胞 基因名称 后续检测 肺癌H1299 RT-PCR、 慢病毒介导的 RNAi 肿瘤生物学 肺癌H1299、 结直肠癌 HCT116、 子宫颈癌HeLa Human Cytosolic FoxO1 RT PCR、 Western Blot、 免疫共沉淀、免 疫荧光、 裸鼠成瘤 免疫 细胞 裸鼠成瘤、免疫 组化 432010年中国
17、科学家使用吉凯基因服务发表的miRNA相关文章 1. J Biol Chem. 2010 Oct 8;285(41):31491-501. IF= 5.328 Vitamin D3 up-regulated protein 1(VDUP1) is regulated by FOXO3A and miR-17-5p at the ti t ildt ti t il llt i l i t f i b b l t transcriptional and post-transcriptional levels, respectively, in senescent fibroblasts. Zhuo
18、 de X, Niu XH, Chen YC, Xin DQ, Guo YL, Mao ZB. 2. BMC Cancer. 2010 Jun 22;10:318. IF= 2.736 ; Hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125a-5p are downregulated in non-small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells. Jiang L, Huang Q, Zhang S, Zhang Q, Chang J, Qiu
19、 X, Wang E. 3. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan 15;391(3):1483-9. IF= 2.548 miR-126 inhibits non-small cell lung cancer cells proliferation by targeting EGFL7. Sun Y , Bai Y , Zhang F, Wang Y, Guo Y , Guo L. ,g ,g , 442011年中国科学家使用吉凯基因服务发表的miRNA相关文章 1. Neoplasia. 2011 Sep;13(9):841-53. IF= 5.476
20、Hypomethylation of the hsa miR 191 locus causes high expression of hsa mir 191 and promotes the Hypomethylation of the hsa-miR-191 locus causes high expression of hsa-mir-191 and promotes the epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma. He Y , Cui Y , Wang W, Gu J, Guo S, Ma K,
21、Luo X. 2. Carcinogenesis. 2011 Dec;32(12):1798-805. IF=5.402 MicroRNA-499-5p promotes cellular invasion and tumor metastasis in colorectal cancer by targeting FOXO4 and PDCD4. Liu X Zhang Z Sun L ChaiNT a n gSJ i nJHu H NieYW a n gXW uKJ i nHF a nD Liu X, Zhang Z, Sun L, Chai N, Tang S, Jin J, Hu H,
22、 Nie Y , Wang X, Wu K, Jin H, Fan D. 3. PLoS One. 2011 Apr 18;6(4). IF=4.132 MicroRNA let-7f inhibits tumor invasion and metastasis by targeting MYH9 in human gastric cancer. Liang S, He L, Zhao X, Miao Y , Gu Y , Guo C, Xue Z, Dou W, Hu F, Wu K, Nie Y , Fan D. 4. Mol Cancer. 2011 Sep 1;10:108. IF=
23、3.779 Upregulation of microRNA-125b contributes to leukemogenesis and increases drug resistance in Upregulation of microRNA-125b contributes to leukemogenesis and increases drug resistance in pediatric acute promyelocytic leukemia. Zhang H, Luo XQ, Feng DD, Zhang XJ, Wu J, Zheng YS, Chen X, Xu L, Ch
24、en YQ. 452011年中国科学家使用吉凯基因服务发表的miRNA相关文章 5 BMC C 2011 O t 5 11 425 IF 3 153 5. BMC Cancer. 2011 Oct 5;11:425. IF=3.153 MiR-125b promotes proliferation and migration of type II endometrial carcinoma cells through targeting TP53INP1 tumor suppressor in vitro and in vivo. Jiang F, Liu T, He Y, Yan Q, Ch
25、en X, Wang H, Wan X. g, , , Q , , g, 6. Brain Res. 2011 May 16;1390:21-32. IF= 2.623 Interaction of hsa-miR-381 and glioma suppressor LRRC4 is involved in glioma growth. TH L iX WZ S hX Z XD ML i QG XW RL iX Tang H, Liu X, Wang Z, She X, Zeng X, Deng M, Liao Q, Guo X, Wang R, Li X, 7. Zeng F, Wu M,
26、Li G. Med Sci Monit. 2011 Dec;17(12):BR364-71. IF=1.669 ;() Recombinant adenoviral microRNA-206 induces myogenesis in C2C12 cells. Zhang W, Wang T, Su Y , Li W, Frame LT, Ai G. 8 E L R 2011 S 37(7) 387 98 IF 1 069 8. Exp Lung Res. 2011 Sep;37(7):387-98. IF= 1.069 MicroRNA HSA-miR-125a-5p induces apo
27、ptosis by activating p53 in lung cancer cells. Jiang L, Huang Q, Chang J, Wang E, Qiu X. 4647分子水平研究（分子机制） 分子水平研究（分子机制） 目前针对功能差异基因发挥功能的机制研究，流行的研究方法主要有以 目前针对功能差异基因发挥功能的机制研究，流行的研究方法主要有以 下三种：芯片+qPCR 验证、酵母双杂+coIP 验证、 Golden pathway Q- PCR 检测。 方法分类 性质比较 芯片+qPCR 验证 酵母双杂+coIP 验证 Golden pathway Q-PCR 检测 说明的问
28、题 找出所研究的目的基因 调控表达的下游信号通 路基因 和所研究的目的基 因结合形式作用的 相关蛋白 找出所研究的目的 基因调控表达的下 游信号通路基因 路基因 相关蛋白 游信号通路基因 实验周期 2 个月 周期长，需3 个月 1 个月 实验风险 低 高 低肿瘤功能基因研究技术 肿瘤功能基因研究技术 肿瘤功能基因研究技术 肿瘤功能基因研究技术 传统研究功能基因是把基因转入细胞看功能表型 1 、 细胞内高表达该基因时，外源表达的基因超过了细 细胞内高表 该 因时 外 源 表的因 超了 细 胞内所需的量而体现不出功能。 2 、 外源高表达基因对细胞也是个刺激压力，会产生假 外源高表 因对细胞 是个
29、刺激压力 会产 假 阳性和假阴性。 当RNA 干扰技术出现后，给科研工作者提供了一个很好研究 内源基因 的工具。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Andrew Z. Fire Craig C. Mello Craig C. Mello Andrew Z. Fire Andrew Z. Fire Craig C. Mello Craig C. Mello 38Nature 1998 391:806-811 2006 年诺贝尔生理学或医学奖授予两 名美国科学家安德鲁菲尔和克雷格梅 洛，以表彰他们发现了RNA 干
30、扰现象。 原位杂交法检测胚胎中mex-3 mRNA A: 杂交液不含探针； B: 未注射入ASO 或siRNA ： C: 注射反义RNA ； 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！ C: 注射反义RNA ； D: 注射dsRNA基因沉默的分子机制模型 基因沉默的分子机制模型 Long dsRNA dsRNA PTGS RISC TGS RNA RNA介导的 介导的基因沉默 基因沉默 mRNA cleavage Chromatin modification Translation arrest 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！RNAi RNAi 中使用的 中
31、使用的siRNA siRNA RNAi RNAi 中使用的 中使用的siRNA siRNA 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！稳定细胞株 稳定细胞株 hepG2单克隆细胞株 L02单克隆细胞株 SMMC 7721单克隆细胞株 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！吉凯基因慢病毒直接动物实验 吉凯基因提供的慢病毒在生产过程中经过 特殊纯化处理 病毒滴度高 并且病毒毒 特殊纯化处理 ， 病毒滴度高，并且病毒毒 性小，可直接用于动物实验。 让我们用心，换取您
32、的放心！ 让我们用心，换取您的放心！利用lentiviral vectors 介导的转基因 （ （ EMBO EMBO reports reports VOL 5 | NO 1 | 2004l VOL 5 | NO 1 | 2004l iit e r a t u r e terature report 29 report 29 ） ） 2007 年1 月，与南 方模式生物中心合 方模式生物中心合 作的实验结果： 转基因小鼠55% 阳 性、80% 表达。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！ 性、80% 表达。利用lentiviral ve c to r s 利用lentivi
33、ral ve c to r s 介导的转基因动物 Michalkiewicz M, Michalkiewicz T, Geurts AM, Roman RJ, Slocum GR, Singer Singer O, Weihrauch D, Greene AS, Kaldunski M, Verma IM, Jacob HJ, Cowley AW Jr. Efficient transgenic rat Efficient transgenic rat production by a lentiviral vector. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007
34、 293(1):881 94 Physiol. 2007 293(1):881-94.功能检测 功能检测 功能检测 功能检测 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！功能检测 功能检测 功能检测 功能检测 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！High content screening High content screening High content screening High content screening Why introduce HCS into gene functional research ？ research ？ Accumulate
35、 the gene resources Promote the screening speed of gene function verification Research Risk Mitigation From the bench to the bedside From the bench to the bedside 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！功能基因研究技术 功能基因研究技术 传统研究功能基因是把基因转入细胞看功能表型 1 、 细胞内高表达该基因时，外源表达的基因超过了细 细胞内高表 该 因时 外 源 表的因 超了 细 胞内所需的量而体现不出功能。 2 、
36、外源高表达基因对细胞也是个刺激压力，会产生假 外源高表 因对细胞 是个刺激压力 会产 假 阳性和假阴性。 当RNA 干扰技术出现后，给科研工作者提供了一个很好研究 内源基因 的工具。 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！RNAi 中使用的siRNA RNAi 中使用的siRNA 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！细胞模型 在300 多株细胞上完成上千个基因的RNA干扰或过表达实验，积 累了丰富的细胞和基因操作经验。 易于被慢病毒感染的细胞列表 让我们用心，换取您的放心！ 让我们用心，换取您的放心！功能结果数据实例： 1.细胞增殖实验：2.细胞周期检测：3.划痕愈伤实验4.细胞运动性(cell motility)5.血管新生实验：6.克隆形成实验
