1、扫描电镜样品的制做与观察,解放军总医院骨科研究所黄靖香,目的,随着组织工程技术的发展兴起，如支架材料 的制作后，需观察样品中的孔径大小 ，与细 胞的相融性，生长形态变化等。用扫描电镜 观察获得清晰图像，是重要的检测手段之一。,电子显微镜分透射和扫描电镜两种，透射电 镜（TEM）是观察样品中的内部结构：如细 胞器等；扫描电镜（SEM）可观察样品中的 表面形态结构。,扫描电镜的优点,景深长，视野广，图像呈三维立体结构，样 品制作较透射电子显微镜简单，功能多，根 据样品性质不同，其处理方法也有所区别， 下面主要介绍组织工程支架、细胞、细胞外 基质等样品的制作技术。,一. 样品制作处理步聚,取样清洗第
2、一次固定（戊二醛）第二 次固定（锇酸）缓冲液中漂洗梯度脱水 醋酸戊酯置换临界点干燥（改成六甲基 二硅胺烷HMDS代替临界点干燥）表面喷 镀扫描电镜中观察。根椐我们的具体情况 加以改进。,1. 材料准备、液体配制： 1）玻璃器皿需泡酸、蒸溜水清冼后灭菌备用。 2）磷酸缓冲液（PBS-0.1M PH-7.4）配制：磷 酸二氢钠2.964g , 磷酸氢二钠29.011g加三蒸水 1000ml，也可用不加酚红无菌Dhankes液代替。 3）固定液的配制：用PBS缓冲液配成2.5%戍 二醛和1%的四氧化锇。,2. 取材准确、固定及时：尽可能保存原貌， 大小适宜（10mm2高5mm左右），对样品表面 用无
3、菌Dhankes液清洗2次，迅速用2.5%戍二 醛4度下前固定4h以上。 3. 观察样品前两天，PBS洗20分钟/次2次， 以下均在室温下，通风橱中进行。 41%四氧化锇酸后固定2h。,缺插图 托上加图片 饿酸固定加图片 单宁酸加图片,5重复步骤3。 6. 2%单宁酸过滤后洗2次，每次30min。 7重复步骤3。 8. 梯度乙醇脱水（50 75 90 100）%2次， 每 次30min，也可在75或90%乙醇中过夜。 9. 醋酸异戊酯置换乙醇40min。,10. 六甲基二硅胺烷原液（HMDS）5-10min替代临界点干燥，放青霉素瓶中抽真空后密 封。 11. 样品用导电胶贴牢贴平，正面朝上，大
4、小适宜。置蒸空干燥器内过夜。 12. 第三天早晨，用离子溅射真空镀膜法喷镀导电金属。 13. 上机观察样品，照相获得二次电子图像。,二. 比较不同干燥方法的优缺点,材料分类 A 单纯支架材料：看孔隙率和孔径大小分布，用普通冷冻 干燥机冷冻干燥法干燥48h的支架粘贴后喷金上机观看干燥喷镀上机观察,B.活细胞不处理环镜扫描直观看细胞活细胞环镜扫描图,C. 细胞常规梯度脱水：用冷冻干燥机处理 细胞收缩，断裂，立体感差。冷冻干燥细胞裂缝 冷冻干燥细胞收缩,D. HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架HMDS处理后的图像,E. HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架 微细结构的观察：纳米材料(ECM
5、),猪ECM胶原 犬神经胶原,脐带ECM胶原 背根神经节基质,F. 常规脱水临界点干燥处理后的样品和六甲基=硅胺烷（HMDS）处理的比较常规处理 HMDS处理,三 注意事项和要求,1. 取材大小适宜，准确定位，首先洗去赘生物后立即固定，防组织细胞的结构自溶或变形。污染物造成图像表面出现絮状物，轮廓不清。 2. 根据不同样品，采用不同的干燥方法，防止因干燥时间过长，压力过大造成样品过度收缩和断裂。样品厚而贴不牢不平，造成喷镀不均，样品边缘空白，发亮而出现充电现象和边缘效应。图像漂移。为此可降低电压（1-5 KV）减少充电和边缘效应。 3. 用单宁酸的目的为提高二次电子发射率，耐受电子轰击，防止样品断裂。,4. 样品脱水干燥贴牢后，需放置玻璃密封真空（加干燥剂）干燥器皿内。样品喷镀后，最好当天观察，照相,如看不完，还需放干燥器中密封真空保存，防灰尘潮气进入。最好勿超过3个月。 5. 因条件有限，无临界点干燥仪，我们采用六甲基二胺烷（HMDS）代替临界点干燥仪，优点是快速经济，不受仪器限制，看普通标本，组织细胞支架材料，与常规临界点干燥处理效果基本一致；看精细材料（ECM）的分辨率还是有差距。 6. 胶原纤维样品梯度脱水前的漂洗液我们采用无菌的三蒸水洗2次，防止盐结晶沉积在样品表面，影响与超微纳米胶原的混淆。,
