1、现代微生物鉴定技术 中国药品生物制品检定所抗生素室 马 越,一 API鉴定系统 二 自动微生物系统 三 分子生物学在细菌分类中的应用,一 API鉴定系统,由于传统的细菌鉴定方法费时、耗力，因此出现多种类型的的成套鉴定系统及编码鉴定系统方法，使细菌鉴定简易化、微量化和快速化。API鉴定系统是在世界范围内应用最广、种类最多的系统。,分类,1）快速鉴定系统 如: Rapideo Z 沙门菌、志贺菌等 2小时 生化反应项目 5 2）特定菌属（群）的鉴定系统 如：API Staph，API Strep 可鉴定28个和35个种，生化反应项目20 3）ATB （Automatic Testing Bacte
2、riology）系统 API方法电脑化，可自动读取鉴定结果，使用时需将鉴定板与自动化仪器结合起来。 4）用于研究细菌对糖的发酵、氧化和同化能力以及细菌所具有的酶谱（Enzymes profile）,数值鉴定的基本原理,数值鉴定是通过出现频率的计算进行的，即每个分类单位的总出现频率与每个菌群中所有菌的总出现频率总和相比较而得。,数值鉴定的应用,生化图谱数码的编码法将生化反应所得阳性和阴性结果，转换成数码，再与索引中数码相比较完成鉴定。,原则：,所有的（20或32个）反应从阳性到阴性的信息浓缩成一组数字。每3个反应为一组， 组内按其位置第一位阳性为1，第二位阳性为2，第三位阳性为4，阴性为0。最终
3、组成一个7位或10位数字。,生化反应图谱索引手册的应用,鉴定%99.9 极好的鉴定 %99.8-99.0 很好的鉴定 %98.9-90.0 好的鉴定 %98.9-80.0 可以接受的鉴定 %79.9以下 低分辨率(不可信),API 系统的操作,接种物的制备 试验条的接种 读取结果,二 自动微生物系统 （AutoMicrobic System AMS）,美国BD公司 BioMerieux ViteK 气相色谱(Gas Chromatography) 鉴定微生物 红外光谱仪（Infrared Spectroscopy） 鉴定微生物,BioMerieux ViteK,BioMerieux ViteK
4、,工作原理,1 革兰阴性、阳性菌的鉴定,主要依据概率是最大拟燃模型法（Probabilistic maximum likelihood model），通过计算机控制，读数仪每小时对孵育室中的测试卡自动扫描一次，进行光学检测，将所得数据送入计算机。因细菌的生长繁殖使测试小池的透光量减少，计算出百分变化值，以判定是否有细菌生长。 计算机对测试菌各反应池结果的处理求出该菌的绝对拟燃值（Absolute likelihood）与内存模型菌比较进行鉴定。,2 厌氧菌的鉴定,利用细菌生长产生的酶，用单一基质酶促反应原理，与测试卡中的少量基质反应，充入厌氧菌的鉴定卡，在非厌氧条件下培养小时，结果输入计算机，
5、作出鉴定。,3 酵母菌鉴定,酵母菌鉴定的测试卡与上述不同，菌液充入试验卡，先在30培养4小时，然后放入读数仪/培育室中读数，鉴定。如需要，计算机将提示再重复培养，测试一次。,仪器的优点,1 功能多可以对革兰阳性，阴性，厌氧菌，酵母菌等作出鉴定 2 速度快 获得纯培养后，充入试卡，一般细菌 在18小时内，酵母菌在2天内，作出鉴定。 3 结果准确 可避免人主观判断的误差。,其他不足,1 酵母菌的鉴定不能仅凭生化反应，要兼顾形态学特征。 2 在少数情况下，AMS系统不能作出鉴定，在排除操作错误以后，可能是该机现有资料库中没有相应的模式。,气相色谱鉴定微生物,原理根据细菌脂肪酸的构成谱（fatty a
6、cid composition profiles）来鉴定细菌。提取未知微生物的脂肪酸，气相色谱仪自动定量测定脂肪酸一确定脂肪酸的构成谱，并与计算机数据库中的参考微生物进行比较，鉴定。该系统可鉴定到属、种、亚种及生化变异型。常用气相色谱鉴定微生物系统有Sherlock Microbial Identification System（MIS）。,MIS系统的标准库 （MIS Standard Libraries） 该标准库包括有需氧菌、厌氧菌、酵母菌，很多领域内有特性的微生物均保存在标准库中。所以MIS系统的标准库可以应用于以下专业的微生物鉴定工作。,医学及临床微生物 环境微生物 植物微生物 工业
7、微生物 食品微生物 兽医 饮用水和废水,MIS系统,仅能鉴定那些标准库中包括或与其相关的菌种。 另外，培养条件和样本制备必须根据要求进行。,注意：,脂肪酸谱与DNA同源性有关，而DNA用于确定种的分类。所以，在有些科里，如肠杆菌科中有些菌种间关系密切，根据生化反应的分类学使该系统的鉴定会有二、三种选择的情况，此时，尚需用其他方法鉴定。 另外，细胞在不同的环境条件中，为维持细胞膜的流动性其脂肪酸的成分有所改变。所以培养基的选择和培养温度一定要按规定进行。,红外光谱仪鉴定微生物（Infrared Spectroscopy） 原理,细菌或其他微生物的红外光谱包含了化合物组分的资料信息，如细胞壁组分（
8、酯类，多糖，多肽），核酸，蛋白质。菌种不同其红外光谱不同，利用这种光谱指纹（spectral fingerprints）与计算机软件库中的标准谱进行比较可以对微生物进行鉴定。,Infrared Spectroscopy的特点,1 快速 2 鉴定所需标本量少 3 自动分析 4 鉴定准确 5 可鉴定到菌株水平 6 对所有微生物可以进行鉴定,三 分子生物学在细菌分类中的应用,1 DNA分子中G+C百分含量的测定 2 DNA-DNA相关度检测-核酸分子杂交技术 3 脉冲场凝胶电泳,1 DNA分子中G+C百分含量的测定,不同种生物DNA分子中硷基组成不同，且较恒定，因而可以用做细菌的分类。,2 DNA-
9、DNA相关度检测-核酸分子 杂交技术,已知的标准菌株和待检菌株的DNA分子高温下变性,冷却后结合, 标准菌株的DNA标记有同位素,可以检测其结合率（相关度）,结合率的高低反应了它们之间的亲缘关系，同种细菌结合率80%以上,同属细菌结合率在60%以上。,3 脉冲场凝胶电泳 凝胶电泳是分子生物学实验室中最常用的分离技术之一，这一技术在生物学测定以及蛋白质和核酸的分离纯化中广泛应用。基因的物理图谱以及DNA顺序测定均依赖于电泳分离。经典的DNA电泳是在琼脂糖或聚丙酰胺固体基质上进行，由一个支流静力电场引导分子迁移，能有效分离的DNA片段长度在50Kb以内。1982年，Schwarz等人首先提出，大于
10、50Kb的DNA片段可通过变化的电场，即脉冲场电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE），加以有效分离。利用此技术，小至几个Kb，大至10Mb的DNA均可得到有效的分离，在生命提的遗传图谱、基因的物理图谱、临床细菌分型、流行病调查、传染源追踪等方面已经得已广泛应用。,(1) 方法学原理 (2) 脉冲场电泳装置 (3) 电泳条件对DNA分离的影响 (4) 应用,(1) 方法学原理,在电场推动下，琼脂糖或聚丙酰胺凝胶以筛滤形式对大小不同的DNA分子起分离作用。DNA分子在泳动时，较小的DNA分子可进入较小的胶孔，较大的分子只能进入较大的胶孔，故需较长时间才
11、能找到可进入的胶孔，因而泳动轨迹弯曲，泳动速度慢。大于30Kb的DNA分子在电泳时只能以头尾牵引方式进入胶孔，如同蛇行一样，凝胶滤过效应不再起作用，从而无法分离DNA。虽然通过降低凝胶浓度和电场强度可在一定程度上解决较大DNA分子的分离困难，但仍然无法解决大于150Kb DNA分子的分离。PFGE的特点是定期改变电场方向，每改变一次电场方向，大的伸展的DNA分子就必须重新定向，在新的方向上通过凝胶。重新定向所需的时间与DNA分子的长度成正比。根据这一原理，通过不断地交替改变电场方向，选择合适的脉冲时间及其它条件，20Kb-10 Mb的DNA分子在凝胶中予以辨认。,(2) 脉冲场电泳装置,高压稳
12、压电源（提供不小于750伏特电压及500mA的可控系统） 电泳槽（缓冲液循环冷却系统）,Pulsed Field Electrophoresis System,(3)电泳条件对DNA分离的影响,电泳缓冲液不同的缓冲液对电泳速度的影响（离子强度） 琼脂糖种类及浓度低电渗琼脂糖使电泳速度加快，超纯琼脂糖较好的分离效果，凝胶浓度过高影响大分子DNA的分离 电压对大分子DNA的分离，适当选择较低的伏特/cm电压梯度 变换电场方向的时间间隔DNA在泳动过程中再定向所需时间和DNA分子的大小呈正相关。 温度电泳时通过循环装置保持缓冲液温度恒定是重要的。常采用的电泳温度为1014。,(4) 应用,Isolates representing the outbreak strain are the recent progeny of a single(or common) precursor Such isolates will have the same genotype Epidemiologically unrelated isolates will have different genotypes,PFGE在MRSA中的应用,谢 谢！,
