1、 浙江农林大学实验室开放项目DNA 和蛋白质的电泳技术姓 名：杨家庆班 级：测绘工程 151 班学 号：201518080113指导老师：杨仙玉完成时间：2016 年 11 月 23 日一、实验名称：DNA 的电泳技术二、实验目的：琼脂糖 凝 胶 电 泳 是 常 用 的 检 测 核 酸 的 方 法 ， 学 习 DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。三、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA 分 子 混 合 物 的 方 法 ， 这 种 电 泳 方 法 以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
2、DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。四、实验器材：仪器：制胶模具、电泳槽、电泳仪、烧杯、锥形瓶、移液枪、手套、微波炉、凝胶成像仪、分析天平、钥匙、离心机、紫外线透射仪、干式恒温器等。试剂：琼脂糖（白色粉末） 、TAE 缓冲液、EB（溴化乙锭-致癌剂，操作中要严格戴手套） ；5、实验步骤：（一）DNA 电泳实验1.模板胶的制作：.称取 1g 琼脂糖加入盛有 100mL 的 1*TAE 溶液
3、中，混合均匀后用微波炉加热至沸腾，加热 2-3 次，每次沸腾之后取出摇匀，直至混合均匀；.待溶液冷却至 40-50时，倒入制胶模具内（注意要快速倒入，以防倒入的过程中溶液凝胶） ，凝固后，上 DNA 样品；.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。2.DNA 凝胶回收：.称量凝胶重量，按质量：体积=1:1 换算，再按凝胶：Buffer G=1:3 加入 3 倍的 Buffer G 溶液放入干湿恒温机中加热融化；.将溶液转入 2ml 离心管中，离心 30s
4、（13200rmp/min） ；.在离心管中再加入 500 微升的 Buffer WS 溶液，离心 30s；.加入 700 微升的 WG 溶液，离心 30s；.离心结束后，倒掉废液，将空的离心管放入离心机空转 30s 或1min，将 DNA 中的残留液体甩干净；离心结束后，将含有 DNA 的薄片快速取出（为防止剩余的酒精再次挥发进入） ；.在放置 DNA 薄片的离心管中加入 20 微升的水（水要从中间加入，打在 DNA 薄片上，待 DNA 溶于水） ，静置 1min，离心；清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。3.凝胶回收后 DNA 片段的电泳：.将胶从凝胶成像仪中取出，在相对黑暗的条件下
5、用紫外光照射，看到清晰地六条条带之后，将相应的条带逐条切下（切的时候尽可能薄，每个条带的重量不要超过 0.3g） ，做凝胶回收，得到相应的DNA 分子；重复制胶过程，在得到的模具中重复上样过程，在第一个孔内上标准 DNA 样品，其余孔内加入相应波长 DNA 样品；.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。（2）PCR（Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应）实验：、配置反应所需试剂：反应体系为 20 微升，首先加入 14 微升
6、水，然后依次加入 2 微升 10*（buffer） 、0.8 微升 DNTPs（四种脱氧核苷酸混合物） 、微升 cDNA（模板 DNA） 、微升引物、1 微升引物（引物 1、方向相反） 、以及 0.2 微升 Taq（DNA 聚合酶） ；、溶液配置好之后，对溶液溶液进行预变性处理，条件 95，时间 2-5min；、预处理过后，进行变性操作，条件 94，时间 30，之后，进行退活，条件 58时间 30s，然后延长反应，72、30；、重复步骤，共循环 35 次；、循环过程结束，在 72下保存min；、制作琼脂糖凝胶，将样品与微升 loading buffer 溶液混合，上样，进行电泳；、将胶移入凝胶
7、成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；、清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。六、实验结果：标准 DNA 上样后成像为（如下左图）：从上到下六条分带分别代表不同大小的 DNA 分子片段，带的粗细表现该片段的含量的多少，如图，从上到下每个条带一次对应的 DNA 分子片段的大小为:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。凝胶回收后，各个不同片段的条带与 MARKER 带的对比成像为（如下右图） ，其中，最亮的条带对应的 DNA 量是 150ng,其余的均为 50ngPCR 实验结果成图为7、结果讨论:影响实验结果的因素有：1.实验过程中仪器操作不当；2.
8、实验过程中液体漏加或加错；3.电泳时电场强度以及电泳液的导电性能的影响；4.实验中所需溶液不同浓度所带来的影响；5.上样时在注入样品的过程中没有成功注入；6.凝胶成像仪使用不当等。八、实验感想和建议:1.通过一学期的实验，我越发的明白实验操作对于结果的重要性。实验操作可以说是实验成功与否的关键部分，可是马虎不得。对于需要团队合作的实验，个人认为要有强势的人员搭档，不说是精通实验操作规程，最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的操作方法，这对于后续的实验无疑是与决定性作用的。对于个人的实验能力，关键还是要看平时的积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，这些都应该是逐渐培养起来的。2.通过这
9、次实验的学习，使我学到了不少实用的知识,更重要的是,做实验的过程,思考问题的方法,这与做其他的实验是通用的，加强了我的动手能力，并且培养了我的独立思考能力，使我受益匪浅.3.通过这次实验的学习，我学到了很多，得到了很多，有些是书本上学不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。也要感谢老师对我们的照顾。蛋白质的电泳实验一、实验名称：蛋白质的电泳技术（SDS-PAGE 电泳）二、实验目的：学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDSPAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。三、实验原理：蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白
10、质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而
11、在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=6.76.8，下层胶 pH8.9；Tris HCI 缓冲液中的 Tris 用于维持溶液的电中性及 pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在 pH6.8 时，缓冲液中的 Gly-为尾随离子，而在pH8.9 时，Gly 的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间 pH 的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝
12、胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于 SDS 带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、
13、重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 四、实验器材：仪器：SDS-PAGE 制胶玻璃板、电泳槽、电泳仪、烧杯、移液枪、手套、微波炉、凝胶成像仪、紫外线透射仪、干式恒温器、磁力搅拌机、磁力搅拌棒等试剂：1.5M Tris-HCL(PH=8.8)、1.0M Tris-HCL(PH=6.8)、10%SDS、10%APS、TEMED 溶液、水五、实验步骤：（一）分离胶的制备：1.将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上（操作时要使两玻璃板对齐以免漏胶） ，再注入入少量琼脂，将其放入恒温振荡器中预热（预热是为了防止因室内温度过低而导致琼脂凝固：加入琼脂是为了防止胶渗漏）
14、 ；2.配置分离胶溶液，按照：1.6ml 水、1.3ml1.5M Tris-HCl(PH=8.8)、2ml aa（acrylaimde 30%） 、0.05ml10%SDS 的量以及顺序配置溶液，并在配置过程中放入磁力搅拌机不停搅拌是混合均匀；3.待玻璃板预热完毕，取出玻璃板，再向溶液中加入0.05ml10%APS（过硫酸铵，催化剂）以及 0.02mlTEMED 原液（催化剂） ，加好后，尽快地倒入玻璃板制胶模具中；4.注入约一半分离胶之后，用蒸馏水注满玻璃板，液封后凝胶更快，静置待其凝胶，若渗漏严重，则需重新制胶。（二）浓缩胶制作1.配置分离胶溶液，按照：1.4ml 水、0.25ml1.0M
15、 Tris-HCl(PH=6.8)、0.33ml aa（acrylaimde 30%） 、0.02ml10%SDS 的量以及顺序配置溶液，并在配置过程中放入磁力搅拌机不停搅拌是混合均匀；2.待分离胶凝胶成功后，倒掉上方蒸馏水，此时，再向浓缩胶溶液中加入 0.02ml10%APS（过硫酸铵，催化剂）以及 0.002mlTEMED 原液（催化剂） ，加好后，尽快地倒入玻璃板制胶模具中；3.注入浓缩胶至注满玻璃板后，插好梳子，等待凝胶。（三）蛋白质电泳1.静置 30 分钟左右，待凝胶结束后，拔出梳子，在孔内加入 maker样品；加样时，用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封
16、用硅胶框,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿 3mm 处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡；2.加样后，通电，在恒流状态下进行电泳，时间 90min；3.电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，得到成胶；4.将胶体放入清水溶液中，用微波炉加热 10s 左右至温热，放入摇床脱色 10min，重复此过程 3 次，过程中要不断换水，直至背景透明蛋白质带清晰为止。5.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。六、实验结果：蛋白质电泳 SDS-PAGE 电泳实
17、验拍照结果为：其中，12%SDS-PAGE 各个条带相对应的蛋白质分子量从上到下应依次为：116kD、66.2kD、45.0kD、35.0kD、25.0kD、18.4kD、14.4kD七、结果讨论:1、在第一次实验中，制作分离胶失败，失败原因可能有：（1）制备琼脂胶体时，胶体未将底部全部密封好；（2）在制备分离胶溶液过程中，溶液成分的量有可能添加错误；（3）制备过程中溶液未混合均匀；（4）在向玻璃板中倒入分离胶时，操作不当或有误；（5）加入琼脂后玻璃板预热过程没有完全预热等。2.影响实验结果的因素有：（1）实验过程中仪器操作不当；（2）实验过程中液体漏加或加错；（3）电泳时电场强度以及电泳液的
18、导电性能的影响；（4）实验中所需溶液不同浓度所带来的影响；（5）上样时在注入样品的过程中没有成功注入八、实验感想和建议:1.通过这次实验的学习，使我学到了不少实用的知识,更重要的是,做实验的过程,思考问题的方法,这与做其他的实验是通用的，加强了我的动手能力，并且培养了我的独立思考能力，使我受益匪浅.2.通过这次实验的学习，我学到了很多，得到了很多，有些是书本上学不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。也要感谢老师对我们的照顾。3.通过一学期的实验，我越发的明白实验操作对于结果的重要性。实验操作可以说是实验成功与否的关键部分，可是马虎不得。对于需要团队合作的实验，个人认为要有强势的人员搭档，不说是精通实验操作规程，最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的操作方法，这对于后续的实验无疑是与决定性作用的。对于个人的实验能力，关键还是要看平时的积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，这些都应该是逐渐培养起来的。
