1、荧光技术原理及应用,陶 亮中山医学院药理学教研室,光的基本知识,一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式光的波长越长，光子的能量越小,光波 波长射线 10-510-3nM X线 10-40.1nM 远紫外 10 20nM 紫外 200400nM 可见光 400760nM 红外 0.7650M 远红外 501000M 微波 0.1100cM 无线电波 1100M,二. 光的性质：粒子性 光子（光量子）波动性 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动,波长 光的颜色振幅 光的亮度,波长长（频率低） 光子能量小 波长短（频率高） 光子能量大,三. 光的吸收,光进入某物质后，部分
2、或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时，以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量发射光。,光的吸收具有选择性 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收,滤光片 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过,（一）荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色,三.荧光的基本知识,2. 荧光产生的原理,无论那种荧光，其发光机理是相同的,由光激发的荧光 光致荧光,由化学反应引起的荧光 化学荧光,由X射线引起的荧光 X射线荧光,由激光引起的荧光 激光荧光,化学荧光在有生命的生
3、物体中产生 生物发光,3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针) 能够产生荧光的化合物,发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数,反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率越大越好,荧光素的荧光效率0.35,斯托克斯位移（Stokes shift）,物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。荧光素的发射波长总是大于其激发波长。两者的差值 斯托克斯位移（Stokes shift）；, 激发到发射过程中存在能量损失,hvEX hvEM = 荧光效率,利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光,4. 荧光素的性质,（1）激发光波长和发射光波长,荧光素,激发光波长近紫外区域，可见光区域,发射光
4、波长可见光区域,发射光波长 激发光波长,根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片,（2）激发光谱和发射光谱,荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质,激发光谱 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱 吸收光谱,发射光谱 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱,Wavelength,Excitation Spectrum,Emission Spectrum,EM,激发光谱和发射光谱的用途,激发光谱确定荧光素适宜的激发波长的依据,发射光谱确定荧光素检测波长的依据,最大激发波长 EX,最大发射波长EM,激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质, 每一种荧光物质都有其特定的激
5、发光谱和发射光谱,（3）荧光强度,荧光强度 荧光素发射荧光的光量子数,决定荧光素检测的灵敏度,荧光素的荧光效率决定其荧光强度,（4）荧光寿命,荧光寿命（激发态寿命）电子在激发态的平均停留时间,荧光寿命长 检测特异性和灵敏度高,荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白,（5）荧光漂白,（6）自发荧光,组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 自发荧光,荧光染料的发展简史,1838年 Brewster首次描述了荧光现象,1852年 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料）,1903年 Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片,1911年 Reicherl发明荧光显微镜,1935年
6、 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和组织，活细胞染色,新的荧光探针，新的检测技术不断出现,荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究,常用的荧光染料（探针）,一. 细胞器荧光探针, 能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。可用于固定和活细胞细胞器的染色,线粒体荧光探针JC-1, Rhodamine 123,溶酶体荧光探针DAMP，Neutral Red,内质网荧光探针 Dioc6(3),Dioc5（3）,Dioc16(3),高尔基体荧光探针 NBD Ceramide, BODIPY Ceramide,二. 细胞骨架荧光探针,F-肌动蛋白荧光探针 BONIPY F
7、L, BONIPY 558/568,G-肌动蛋白荧光探针DNase I+荧光素,Alexa Fluor 488 Oregon Green 488 Texas Red,微管蛋白荧光探针 ,秋水仙减+荧光素 DAPI DCVJ Bis-ANS,微管选择性紫杉醇探针,Flutax-2 BODIPY FL Placlitaxel BODIPY 564/570 Placlitaxel,三.研究钙调节和活性的荧光探针,钙调蛋白荧光探针 钙的类似物三氯化忒,PKC荧光探针用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针,钙离子荧光探针,Quin-2-AM Fura-2-AM Fura-3-AM,紫外光激活,
8、可见光激活,三.核酸荧光探针,能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析,胞膜透过性核酸荧光探针 用于细胞染色,非透过性核酸荧光探针用于DNA琼脂凝胶电泳,EB和PI PO-PRO和BO-PRO AAD ACMA,SYTO AO Hoechst DAPI,四. 其它荧光探针,受体 酶 生长因子 离子通道 等等,绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物,1.GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一 种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和 肠腔素结合后可产生蓝色荧光。,然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿
9、色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）,GFP的特性与优点,1.GFP的光谱特性 ,最大激发波长 460-490 nm 发射波长 500-550 nm,GFP的特性：,2. GFP的分子量小（20kDa）当与其它蛋白组成融合蛋白 时，不影响结合蛋白的功能,GFP的优点：,1.可溶性蛋白，性质稳定 2.荧光强，易加工到其它蛋白质序列上 3.无进入细胞问题，标记可靠 4.表达GFP融合物的细胞，可在生活状态下进行实验和检测 5.对细胞无毒,GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒 转基因动物: Green mouse 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP
10、 DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成,GFP的应用：,荧光检测仪器,1. 荧光分光光度计,用于大容积样本（ul,ml)的测量,2. 荧光显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）,用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量,荧光显微镜,激光共聚焦荧光显微镜,3.流式细胞仪（FCM）,对处在快速直线流动细胞状态中的细胞或生物颗粒进行快速定量分析和分选；用于把指定参数参量的细胞亚群从整群细胞中分选出来。,4.小动物活体成像系统,对荧光素标记的生物分子和细胞在整体水平进行检测,KCL诱导的细胞外Ca+内流测量,活细胞内离子动态变化测量,
