1、植物发育生物学研究方法,2,发育生物学,遗传学,生物化学,细胞学,生理学,分子生物学,免疫学,发育生物学在生命科学中的地位,植物发育生物学常用研究方法及原理,突变体库构建基因沉默（RNAi）蛋白质互作研究,突变体的诱导与选择 正向遗传学,突变体的诱导与选择,随着大量物种全基因组序列测序完成，对基因的研究进入了以功能基因组学为代表的后基因组时代。功能基因组学是在结构基因组学丰富信息资源的基础上，利用植物全基因组序列的信息，应用各种实验方法并结合统计和生物信息学方法研究和分析基因的表达、调控与功能以及植物的生长、发育规律的学科。要了解植物体内各基因的生物学功能，如何协调发挥作用，参与一系列的生长发
2、育过程，就需要我们精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用；构建基因突变体库，通过突变体分析鉴定基因功能是一种最直接最有效分析鉴定基因功能的方法。,突变体的诱导与选择,突变体可以通过植物自发突变产生，不过研究中常常通过人为手段诱导获得突变体。一般来说，单个植株自发突变的频率介于千分之一至万分之一，单个基因自发突变的频率则介于十万分之一至百万分之一。除了自发突变外，体细胞无性系也会产生突变体。不过最常见的突变体还是通过人工诱变的方法产生的，如理化诱变突变体和插入突变体。 自发突变是在自然条件下发生的突变，是生物变异的重要来源和自然进化的基础。但是自发突变的频率较低，而且许多突变常常是致死型或通过
3、表型无法鉴定而无法获得，因此系统收集自发突变体存在很多困难。即使获得感兴趣的突变体，分离突变体基因和鉴定其功能也是比较困难的。,突变体选择的概念组织培养筛选突变体的方法，又称离体筛选。 组织培养过程中表现出的变异，体细胞无性系变异 在培养基中加选择压（化学物质）诱导产生变异，具有定向突变特征。植物细胞工程目前分为五个分支： 脱毒与快速繁殖。 细胞的大量培养。 体细胞杂交。 细胞遗传转化及产生转基因植株。 无性系变异与分离突变体。后三者则主要利用遗传变异，创建新种质。,离体筛选的优点： 离体筛选突变体的可控程度高，便于进行定向选择。 突变频率高，筛选群体大，在较小容器中可操作百万到千万个植物细胞
4、。离体筛选的意义： 对农作物形状进行遗传改良；为细胞杂交和转基因技术提供选择标记，如互补选择；对突变体细胞进行遗传及生理代谢研究。 突变是遗传变异性的终极来源，它为种群变异提供原材料。是体现生物多样性和适应多变环境的重要方式。,二、变异的类型,1. 农作物的品质改良,食品的营养价值主要取决于种子中蛋白质和氨基酸的含量，特别是氨基酸的组成和含量。谷类作物中的多数作物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸含量偏低，而在一些豆类作物中蛋氨酸偏低。如赖氨酸含量在玉米中约为0.3%，小麦在0.34%左右。 作物体内某些特定的氨基酸在细胞内保持一定的浓度，过高回发生毒害作用。而某些细胞一旦获得对这些氨基酸的抗性后，可大
5、大减轻这些毒性，从而允许细胞内这些氨基酸及类似物的过量积累，这些氨基酸也许就是对人们特别有用的氨基酸。如获得高赖氨酸细胞系的突变植物类型，就可达到改良品种的目的。,2.抗病突变体 当病原菌侵染植物组织后往往会产生一种毒素，破坏寄主细胞正常的代谢，严重的甚至导致细胞的死亡。病原毒素一般为一些次生产物，如糖苷、萜类、酚类或氨基酸类似物等。在培养基内加入某种病原毒素可淘汰不抗病的细胞，筛选出可以抗病的细胞。,3 抗逆突变体 耐盐突变体的筛选是通过在培养基中加入高盐浓度，甚至海水来进行的。在盐浓度逐渐增加的条件下，诱导并筛选出耐盐的细胞系。 Dix和Steet（1975）利用加入NaCl的液体培养基，
6、培养辣椒和烟草，结果得到一种可在含1%2% NaCl条件下生存的抗盐突变细胞株，培养几代在回到含盐培养基中，仍具有抗盐性。在抗盐细胞中游离脯氨酸积累量增加，表明脯氨酸与植物抗盐性的关系。 Dix和Steet用辣椒愈伤组织细胞进行悬浮培养，用甲基磺酸乙酯（EMS）作为诱变剂，在0-3条件下，得到两个抗低温的突变细胞系。 抗UV植物细胞克隆,三、变异的来源1 .离体培养细胞的自发突变组织培养后植株变异的原因：组织培养过程中引起的可遗传的变异。植株的再生方式、生长调节物质、继代培养的时间。由外源遗传及生理作用引起的变异植物的细胞、组织、在离体培养时，由于环境条件可以人为控制和培养基中化学因素的影响，
7、会发生各种各样的变异，外植体体细胞发生的变异称为体细胞变异,体细胞无性系变异的特征表现在：随机性，无法精确地分批重复。再生植株的遗传变异性广，包括染色体变异，畸变，点突变，转座，以及线粒体和叶绿体基因组的改变等。,2. 人工诱发突变 物理方法：主要有X射线，r射线处理，32P、14C等。有时用热中子或快中子处理。物理诱变的好处是，使用方便，干净，穿透力强，重复性好，突变频率高，但需专门的设备。 化学诱变：在组织培养中常用化学诱变剂处理，好处是不需专门设备，操作方便，由于处理的材料是组织块、细胞团、游离的单细胞或原生质体，因此可以在一定程度上克服化学诱变剂穿透力差的缺点。所以对培养组织进行诱变，
8、目前较多采用化学诱变剂。用各种诱导剂处理可以提高突变频率10100倍，下面介绍植物组织培养诱变中常用的诱变剂的种类和使用方法。,烷化剂 甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、乙基磺酸乙酯（EES）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲（ENH）等。 烷化剂是栽培作物中诱发突变极其重要的一类化学诱变剂，它带有许多活烷基，烷基能够转移到其他分子中电子密度极高的位置上去，这种通过烷基在分子内的置换作用称为烷基化作用。这些物质通过磷酸基、嘌呤、嘧啶基的烷化而与DNA作用，最终引起遗传物质的破坏、修复与错误修复的各种酶促反应而发生变异。,亚硝基胍（NTG，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍）是已知的最
9、强的化学诱变剂，在合适的条件下可产生很高的突变率，而致死率较低，利用浓度的不同可控制突变率的高低，常用的浓度为1050g/ml。用这种化学诱变剂处理后，通过离心或微孔滤膜过滤的方法收集细胞，然后用水或培养液洗涤后植平板。 叠氮化物是在常规诱发突变中对植物诱变效果最好的一种诱变剂，在诱发大麦、豌豆、小麦、水稻等作物上都能获得高的诱变率。 对大麦叶绿素缺失突变体诱变的效果，比射线和中子诱导率高，对人毒性小，对植物引起的损伤也小。射线和中子诱变率为10%，叠氮化钠诱变率为40%50%。,四、突变体的选择方法1.直接选择法通常是把细胞培养在一种亲本细胞不能生长的培养基上，或亲本细胞死亡的培养基上，即施
10、加选择压。经诱变或未经诱变的培养组织都可用增加选择压抑制未突变细胞生长的化学物质的方法进行选择。在培养基中施加不同的选择压可以对所需要的性状进行定向选择。如以抗植物毒素（选择压）选择抗病性，以高浓度的盐选择耐盐性，以高浓度的除草剂或农药选择耐药性，以某种代谢中间产物为选择压筛选高氨基酸、高糖的优质谷物新品种。 例如，要分离某种除草剂有抗性的突变体，首先是把培养的材料接种在含一系列浓度除草剂的培养基上，测定最低的开始抑制生长的浓度。对能进一步生长的组织可以在含一系列浓度的除草剂的培养基上进行在培养，以确定其耐药的最高极限浓度。,定向基因突变,T-DNA插入突变 转座子插入突变,T-DNA插入法主
11、要是利用农杆菌Ti或Ri质粒中的一段转移DNA序列，从农杆菌中转移并稳定整合到植物的基因组中。由于农杆菌转化技术的成熟和广泛使用，因此通过大量T-DNA独立转化子建立T-DNA插入突变体库，是一种快速构建插入突变体库的方法之一。以拟南芥为例，目前为止，已经构建了22500多个拟南芥T-DNA插入突变体，获得约360000个T-DNA插入位点序列，几乎涵盖了拟南芥整个基因组，使得研究和分析植物生长发育过程中各个相关基因的功能成为现实。转座子插入法主要是利用来自于玉米的Ac和Ds转座子能在植物基因组中跳动，且跳动后经常以高频率在原位点附近再插入从而破坏原位点周围的基因为原理。目前通过转座子插入系统
12、已经获得多种包括植物和微生物在内的各种突变体库，为分析基因在植物生长发育过程中发挥的功能提高大量的材料。,基因沉默 反向遗传学,基因沉默的概念及发现,基因沉默（Gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。 基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着和线虫、真菌、昆虫、原生动物以及才鼠中陆续发现。大量的研究表明，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等都与基因沉默有关。,RNAi的发现,20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪的发现：Rich Jorgense
13、n和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。,野生型,试验,预测,RNA interference,1995，RNAi现象首次在线虫中发现。 1998，RNAi概念的首次提出。 1999，RNAi作用机制模型的提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现RNAi现象。 2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞
14、基因沉默现象。RNAi 技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。 至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门的方向之一。,1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA 以期观察到基因表达的增强。结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,RNAi的提出,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发
15、现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域
16、中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,RNAi的定义,目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。,如果将其作为一门生物技术，则定义为 ： RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形
17、成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。,RNAi的
18、定义,RNAi 机制,RNAi作用的简单模型,当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。,RNAi引发的基因沉默机制,Gisela
19、Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.,RNAi在植物与其他生物中的差异,在植物中存在系统性沉默(systematic RNA silencing)现象，RNAi不会局限于单个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。 植物中存在转移性沉默(transitive RNAi)，对于转基因植物中的外源基因，如果dsRNA诱导的RNA沉默区域对应于基因的中间区域，能检测到与其侧翼区段对应的siRNA。但内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性。这两种现象在线虫中也有发现,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。 植物中的RN
20、Ai跟两种不同大小的siRNA有关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目的mRNA，而24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现21nt的siRNA。,RNAi研究的一般技术路线,RNAi的效果分析,可从mRNA和蛋白质两方面进行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。 蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。,RNAi在植物功能基因组研究中的应用,RNAi为大规模高效及复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台 。 Chuang等在花发育研究中采
21、用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用 。 Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体，成功的对OsRac基因家族进行了沉默，发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用,RNAi在作物品质改良中的应用,尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗时，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料 而利用RNA沉默技术，其优越性不仅表现
22、在可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性,利用RNA沉默产生抗病毒植物,将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物体使之表达,可诱发RNA沉默强化植物体内天然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能 。 Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。 Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传,内源RNAi,蛋白质相互作用研究技术
23、,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交 谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down） 免疫共沉淀 双分子荧光互补技术(BIFC) 生物发光共振能量转移（BRET）技术,常用蛋白质相互作用的研究技术,一、细菌双杂交系统,Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核
24、生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4 （酵母转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。,酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成的转录激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）
25、与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。,酵母双杂交实验过程,酵母双杂交基本过程,举 例,二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理,GST,X,Y,谷胱甘肽-琼脂糖球珠,细胞裂解物,tube,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,Y,+,三、免疫共沉淀原理,四、双分子荧光互补技术( bimolecular fluorescence complementation , BIFC),BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白
26、因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作用有重要意义。,BIFC的优势,在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用的蛋白发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。,五、生物发光共振能量转移（BRET）技术,BRET技术是近年来出现的一种新的检测蛋白质蛋白质相互作用的技术。是建立在非辐射能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体发光酶（lux）和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白G）之间会发生能量转移。供体发光酶在相应底物存在时发射光波。能量受体是荧光蛋白，在一定波长范围内吸收光波，并在一定的波长范围内发射光波。将两个目的蛋白分别和供体和受体形成融合蛋白，两个目的蛋白之间距离足够近并发生相互作用，即可检测到BRET信号。,
