1、常规试剂配制和测定方法一、 溶液的配制1. Mandels 营养盐溶液（1000 mL）名 称 重 量（g）硫酸铵（(NH 4)2SO4） 14磷酸二氢钾（KH 2PO4） 20尿素 （H 2NCONH2） 3硫酸镁（MgSO 47H2O） 3氯化钙（CaCl 22H2O） 4注：用煮沸 10 min 后的蒸馏水配制。2. Mandels 微量元素溶液（1000 mL）名 称 重 量（g）氯化钴（CoCl 26H2O） 3.7硫酸锌（ZnSO 47H2O） 1.4硫酸锰（MnSO 4H2O） 1.6硫酸亚铁（FeSO 47H2O） 5.0注：用煮沸 10 min 后的蒸馏水配制。3. DNS
2、试剂的配制（1000 mL）（1） 取：3,5-二硝基水杨酸 （C 7H4N2O7） 7.5 g氢氧化钠 （NaOH ） 14.0 g充分溶解于 1000 mL 水中（水预先煮沸 10 min）（2） 加入：酒石酸钾钠 （C 4H4O6KNa4H2O） 216.0 g 苯酚（在 50 水浴中融化） 5.5 mL偏重亚硫酸钠 （Na 2S2O5） 6.0 g（3） 充分溶解后盛于棕色瓶中，放置 5 天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中时要尽量装满！4. 考马斯亮蓝 G-250 的配制（1000 mL）称考马斯亮蓝 G-250 100
3、 mg 即 0.1g 溶于 50 mL 95%乙醇中，加入 100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含 0.01 %（w/v）考马斯亮蓝 G-250，4.7 %（w/v）乙醇，8.5 %（w/v ）磷酸。5. 1.0 M 柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）名 称 分 子 量 Mn 重 量 (g)柠檬酸（C 6H8O7H2O） 210 210NaOH 40 74.5 准确称取柠檬酸 210 g，溶于约 750 mL 煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠 74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到 1000 mL 容量瓶中，冷却后
4、将容量瓶定容到 1000 mL（原始 pH4.45） 。 （检验方法：取 1.0 M 柠檬酸缓冲溶液稀释 20 倍，测定稀释液的 pH 值，pH 值应为 4.8）6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定（1） 标准糖溶液的配制准确称取 2.000 g 葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需 105 烘干 3 h） ，蒸馏水溶解，全部转移至 1 L 容量瓶内，摇匀，配制成 2 g/L 葡萄糖 /木糖溶液。取 9 个 100 mL 容量瓶、1 支 20 mL 刻度吸管，分别吸取 2 g/L 葡萄糖/木糖溶液 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90
5、mL 依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为 0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、 1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L 葡萄糖/ 木糖标准溶液。取 6 个 30 mL 容量瓶、1 支 20 mL 刻度吸管，分别吸取 2 g/L 葡萄糖溶液 10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL 依次加入容量瓶，每瓶再加入 1.5 mL 柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为 1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g 酶解葡萄糖。（2） 标准方程的测定： 葡萄糖 /
6、木糖标准方程的测定取 10 支 25mL 刻度管，10 支 1mL 刻度吸管，分别加入 0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L 葡萄糖/ 木糖标准溶液 1 mL，DNS 溶液 3 mL。100 煮沸 5 min，水浴冷却后定容至 25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm 测定吸光度 A。以 A 为纵坐标，C 为横坐标，制定标准曲线。 （7230 型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723 型分光光度计输出方程为：C = KA + B） 酶解木糖标准方程测
7、定（测定木聚糖酶活力）取 6 支 25 mL 刻度管，6 支 2 mL 刻度吸管，分别加入 1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g 酶解木糖标准溶液 1.5 mL，DNS 溶液 3 mL，100 煮沸 5 min，水浴冷却后定容至 25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm 测定吸光度 A。以 A 为纵坐标，C 为横坐标，制定标准曲线。 （7230 型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723 型分光光度计输出方程为：C = KA + B） 酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、 CMC 酶活力）取 6 支小试管，6 支 2 mL 刻度吸管，
8、分别加入 1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g 酶解葡萄糖标准溶液 1.5 mL，DNS 溶液 3 mL，100 煮沸 5 min，水浴冷却后，量筒定容至 50 mL（定容至 25 mL，测定 CMC 酶活力） ，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm 测定吸光度 A。以 A 为纵坐标，C 为横坐标，制定标准曲线。 （7230 型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723 型分光光度计输出方程为：C = KA + B）7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制pH0.1 mol/L柠檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠 /mL pH0.1 mol/L柠檬
9、酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠 /mL2.2 19.60 0.40 5.2 9.28 10.722.4 18.76 1.24 5.4 8.85 11.152.6 17.82 2.18 5.6 8.40 11.602.8 16.83 3.17 5.8 7.91 12.093.0 15.89 4.11 6.0 7.37 12.633.2 15.06 4.94 6.2 6.78 13.223.4 14.30 5.70 6.4 6.15 13.853.6 13.56 6.44 6.6 5.45 14.553.8 12.90 7.10 6.8 4.55 15.454.0 12.29 7.71 7.
10、0 3.53 16.474.2 11.72 8.28 7.2 2.61 17.394.4 11.18 8.82 7.4 1.83 18.174.6 10.65 9.35 7.6 1.27 18.734.8 10.14 9.86 7.8 0.85 19.155.0 9.70 10.30 8.0 0.55 19.45注：Na 2HPO4，Mr =141.98；0.2 mol/L 溶液为 28.40 g/LNa2HPO42H2O，Mr =178.05；0.2 mol/L 溶液为 35.61 g/LC6H8O7H2O，Mr =210.14；0.1 mol/L 溶液为 21.01 g/L二、 酶活力的测
11、定1. 滤纸酶活力的测定纤维素酶的总体酶活力采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定 Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成 1 mol 葡萄糖量的酶量。测定方法如下：取 7 支试管在其中 1#-5#支小试管中加入 50 mg 卷成筒状的滤纸条（ 1 6cm） ，适当稀释酶液，取 7 支试管按下表操作。 （5 #有底物无酶，6 #为有酶无底物空白对照）项 目 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#稀 释 酶 液 （ mL） 0.2 0.3 0.
12、4 0.5 0 0.50.05 M 柠 檬 酸 缓 冲 液（ mL）1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1酶解葡萄糖标样 1.5mL将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅 80和温度 50 下保温 60 min 后立即取出加入 3 mL DNS 试剂，在沸水中反应 5 min，冷却后加水至 50 mL 并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于 550 nm 波长下测定吸光度 A 值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。以 0.2、0.3、0.4、0.5mL 酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成 2 mg 葡萄糖的酶量，
13、按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：滤纸酶活力 = 2 mg 葡萄糖60min0.18(mg/mol)生成 2mg 葡萄糖的酶量（ mL）一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成 1mol 葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。备注：当加入 0.5 mL 酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成 2 mg 葡萄糖时，按下式计算：滤纸酶活 = 0.185 （葡萄糖 mg 数）2. -葡萄糖苷酶活力的测定方法一：葡萄糖氧化酶测定法按国际标准方法测定Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268。一个 -葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件
14、下每分钟转化 1 mol 底物即生成 2 mol 葡萄糖的酶量来表示。预先用 0.05 M 的柠檬酸缓冲液配制 15 mmol/L 的纤维二糖溶液（0.513 g 纤维二糖/100 mL0.05 M 的柠檬酸缓冲液，现配现用） （1） 每个样品应做三个不同酶量估计 -葡萄糖苷酶活力（IU/mL ） 0.10.1 0.2 0.3取酶液量（mL） 0.5/0.8/1.0 0.3/0.5/0.8 0.2/0.3/0.5 0.1/0.2/0.3（2） 加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：酶液量（mL）0.05 M 柠檬酸缓冲液（mL ）纤维二糖溶液（mL）样品 适量 1酶液 1酶液空白 1
15、 1 0纤维二糖空白 0 1 1每个试管共 2mL，用塑料纸包扎好。注意：纤维二糖溶液必须用 0.05M 柠檬酸配制。（3） 酶解反应：试管置于 50 水浴中，保温 30 分钟，取出，沸水中放置 5 分钟使酶失活，冷却至室温。（4） 加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液 30 L，加入显色剂3.0 mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取 1 g/L 葡萄糖标样 30 L，加显色剂 3.0 mL，混匀；置于 37 水浴中，保温 15 分钟，取出。（5） 测吸光度：505 nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度 A 值。1g/L 葡萄糖标样的吸光度为 0.7 左右。（6） 计算产生的葡萄
16、糖 mg 数：样 品 吸光度测得 酶 空 白 所含葡萄糖 = 2 （mg）纤维二糖空白 1g/L 葡萄糖标样吸光度样品实际产生的葡萄糖 = 测得葡萄糖 mg纤维二糖空白葡萄糖 mg酶空白葡萄糖 mg 酶液量 mL （mg）注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。（7） 作图：以 log(酶液量 mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖 mg 为横坐标作图，求出生成 1 mg 葡萄糖时对应的酶液量 mL。（8） 计算 -葡萄糖苷酶活力：0.0926-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL）生成 1mg 葡萄糖对应的酶液量（mL）注：当加入 1mL 酶液仍不能生成 1mg 葡萄糖时
17、，-葡萄糖苷酶活力 = 0.0926（葡萄糖 mg 数）补充：葡萄糖含量测定采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含 R1（缓冲液）和 R2（酶试剂） ，使用时将 R1 和 R2等量混合。葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将 4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。测定方法如下：在测定管中加入 30 L 待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L 的葡萄糖标准溶液代替） ，每一试管中加入由 R1 和 R2 等量混合的酶
18、酚混合液3.0mL，将各试管分别摇匀，置于 37水浴中保温 15min，冷却至室温后，在7230 分光光度计上于 505 nm 下测定吸光度 A 值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：葡萄糖含量（g/L）= 稀释倍数方法二： 采用 pNPG（对硝基苯酚-D-葡萄糖苷）试剂测定（1） 试剂的配制 50 mmol/L , pH 4.8 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200 mL）方法：0.1 mol/L 柠檬酸 101.4 mL + 0.2 mol/L 磷酸氢二钠 98.6 mL 1 mol/L Na 2CO3 溶液（250 mL）称取：26.5 g Na 2CO3 溶解后定容至
19、250 mL 5 mmol/L pNPG（分子量：301.25）溶液的配制（100 mL）称取 0.1506 g pNPG，用 50mmol/L，pH4.8 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至 100 mL。 （2） 对硝基苯酚标准方程的测定 对硝基苯酚标准溶液的配制准确称取 0.0209 g 对硝基苯酚（分子量：139.11） ，蒸馏水溶解，全部转移至100 mL 容量瓶内，摇匀，配制成 1.5 mmol/L 对硝基苯酚溶液。取 6 个 30 mL 容量瓶，分别吸取 1.5 mmol/L 对硝基苯酚溶液 1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、 10 mL 依次加入容量瓶，蒸馏水
20、定容，摇匀。即为 0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L 、0.5 mmol/L 。 对硝基苯酚标准方程的测定取 6 支 15 mL 刻度管、6 支 1 mL 刻度吸管，分别加入 0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L 对硝基苯酚溶液1.0mL，再加入 2.0 mL 1 mol/L 的 Na2CO3 溶液和 10 mL 的蒸馏水，室温放置 5 min 后，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在 400 nm 下测定吸光度 A。以 A 为纵
21、坐标，C 为横坐标，制定标准曲线。测定管吸光度标准管吸光度（3） 测定方法游离酶酶活力的测定：0.1 mL 适当稀释的酶液与 0.9 mL 5 mmol/L pNPG 溶液（分别预热 5 分钟）混合后，于 50 下保温 10 min。 10 min 后立即加入 2 mL 1 mol/L Na2CO3 溶液终止反应后，再加入 10 mL 的蒸馏水，摇匀。 在 400 nm 下测定吸光度。以 0.1 mL 蒸馏水代替酶液作空白对照。 （要做 23 个平行样，取平均值）固定化酶酶活力的测定：将游离酶酶活的测定方法中 0.1mL 适当稀释的酶液用 0.1mL 蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤
22、相同。（4） 酶活力的计算一个 -葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：每分钟水解生成 1 mol 对硝基苯酚所需要的酶量。计算公式如下： 游离酶酶活力的计算：生成对硝基苯酚的量（mol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/mL）10 min0.1 mL固定化酶活力的计算：生成对硝基苯酚的量（mol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/g）10 min 称取固定化酶的质量（g）3. 羧甲基纤维素（CMC）内切葡聚糖酶活力（1） 在 25 mL 刻度试管中加入 0.5 mL 适当稀释的酶液和 1.0 mL 用 0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制的 1 %（w/v）羧甲基纤维素悬浮液。（2） 盖上塑料布，用橡皮筋
23、扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅 80 和温度 50 下保温 30 min 后立即取出加入 3 mL DNS 试剂，在 100 沸水中煮沸 5 min，冷却到室温后，加水定容至 25 mL，充分摇匀后于 550 nm 波长下测定吸光度 A 值。（3） 反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。按下式计算 CMC 酶活力：CMC 酶活力 = 生成的葡萄糖的量（mg）30min0.18(mg/mol)0.5mL一个 CMC 酶活力单位定义为每分钟生成 1mol 葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。4. 木聚糖酶活力的测定用 0.05 mol/L 柠檬酸缓冲液配制的 1%（w/v）桦木木聚糖（S
24、igma 公司制造）溶液。适当稀释酶液，取 7 支 25 mL 刻度试管按下表操作（5 #有底物无酶、6 #为有酶无底物空白对照） 。项 目 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#稀 释 酶 液 （ mL） 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.50.05M 柠 檬 酸 缓 冲 液（ mL）0.3 0.2 0.1 0 0.5 11%桦 木 木 聚 糖 （ mL） 1 1 1 1 1 0酶解木糖标样1.5mL将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅 80和温度 50 下保温 30 min 后立即取出加入 3 mL DNS 试剂，在沸水中反应 5 min，冷却到室温后，
25、加水到 25 mL，充分摇匀后于 550 nm 波长下测定吸光度 A值。根据木糖标准曲线（用木糖的绝对量对吸光度 A 值作图） ，找出反应所产生的木糖量（扣除空白值） 。以 0.2、0.3、0.4、0.5 mL 酶量所生成木糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成 2 mg 木糖的酶量，按下式计算木聚糖酶活力：木聚糖酶活力 = 2mg 木糖30 min0.15(mg/mol)生成 2mg 木糖的酶量一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成 1mol 木糖所需的酶量，单位：IU/mL。三、木聚糖的测定方法1、准确吸取 5mL 搅拌均匀的木聚糖溶液于 250 mL 三角瓶中，加入 5
26、 mL 8 %的硫酸，摇匀后用牛皮纸和橡皮筋将三角瓶的瓶口扎住。2、将三角瓶置于灭菌锅中于 121 条件下保温 60 min，冷却后取出。3、将三角瓶中的水解液倒入 200 mL 烧杯中，加入 100 mL 左右的水（注意少量多次洗涤三角瓶） ，用 15 %的 NaOH 溶 液 中 和 至 pH 值 为 6.5 7.0。4、 将 中 和 液 定 容 到 200 mL（ 量 筒 ） 。5、 用 DNS 法 测 得 中 和 液 的 还 原 糖 浓 度 c， 则 被 测 样 品 的 木 聚 糖 浓 度 C 为 ：C = c400.9式中：C 木聚糖浓度，g/Lc 水解液中木糖浓度0.9 木聚糖和木糖
27、的转化系数6、每个样品做 2 个平行样。注意：木聚糖的聚合度是用 c40 除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。四 、 可 溶 性 蛋 白 质 的 测 定采 用 Bradford 测 定 方 法 。 测 定 试 剂 采 用 Bradford 试 剂 （ Sigma 公 司 ） 。 常 量 分 析 法 。 取 5 个 蛋 白 质 标 准 样 品 （ 分 别 含 牛 血 清 蛋 白 0.2、 0.4、 0.6、 0.8和 1.0 mg/mL） ， 1 个 空 白 对 照 （ 蒸 馏 水 ） 和 所 有 待 测 试 样 各 0.1 mL 于 10 mL 具 塞 试 管中 ， 顺 试 管 壁 分 别
28、加 入 3.0 mL Bradford 试 剂 ， 将 试 管 小 心 上 下 翻 转 几 次 使 液 体 混 合 均匀 （ 注 意 尽 量 不 产 生 泡 沫 ） ， 在 加 入 染 色 剂 后 的 5-60 min 内 ， 于 595 nm 波 长 下 测 定 各样 品 的 吸 光 度 A 值 。 以 同 样 处 理 的 空 白 作 为 对 照 。 当 蛋 白 质 浓 度 在 0.2-1.0 mg/mL 范围 内 时 ， 吸 光 度 A 值 与 蛋 白 质 浓 度 之 间 呈 线 性 关 系 。 作 出 蛋 白 质 浓 度 标 准 曲 线 后 ，由 待 测 试 样 的 A 值 可 求 得 蛋 白 质 的 浓 度 。 微 量 分 析 法 。 当 蛋 白 质 浓 度 较 低 时 ， 可 采 用 微 量 分 析 法 来 测 定 蛋 白 质 浓 度 。 取5 个 蛋 白 质 标 准 样 品 （ 分 别 含 牛 血 清 蛋 白 2、 4、 6、 8 和 10 g/mL） 和 待 测 试 样 各 1.0 mL 于 10 mL 具 塞 试 管 中 ， 顺 试 管 壁 分 别 加 入 1.0 mL Bradford 试 剂 ， 其 余 步 骤 与 常 量分 析 方 法 相 同 。
