1、 工业淀粉酶的纯化与分析一实验目的1 掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法2 掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术3 掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法4 学习 Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法二实验原理工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。利用葡糖糖凝胶 G-25 对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化学反应的初速度来表示的。在本实验中，是以一定量的淀粉酶在 37 摄氏度，PH=6.8 的条件下，每分钟水
2、解淀粉酶生成 1mg 还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用 DNS 法测定。蛋白质在 Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在 500nm 波长下的吸光度 ，从而求得样品中蛋白质的含量。三实验材料及仪器设备1 材料：工业淀粉酶2 仪器：电子天平；离心机；UV9100 型分光光度计恒温水域；沸水浴3 器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1;研钵：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；层析装置：1 套；量筒：100ml*1；洗耳球：2 个；胶头滴管：2 个；移液管架；
3、玻璃棒四实验试剂BaCl2 溶液（1%） 考马斯亮蓝 G-2501%NaCl 溶液 淀粉溶液（0.5%）磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH 6.8） NaOH 溶液（2.5mol/L）牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml）Folin-酚试剂甲 Folin-酚试剂乙葡萄糖标准液（1mg/ml） DNS 试剂五实验步骤1. 浸提称取 0.317g 淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液 1.2ml 于离心管中，标记为“粗酶液”备用。记录剩余体积为 18.2ml 并转移到 50ml 烧杯里，置于冰浴中。2盐析按 70%的饱和浓度称取 6.976g(NH4)2SO4固体，研细后，缓缓加入离心后的
4、酶液中。待(NH 4)2SO4固体溶解后，冰浴静置 20min 后离心，将离心后固体溶解于 4ml 蒸馏水中，并分装于 3 支 1.5ml 离心管中，标记“盐析”备用。3脱盐用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后,对蛋白质进行脱盐。用注射器注射 0.5ml 盐析液，上样完毕后，打开出水口，进行洗脱，并收集洗脱液，每管2ml。分别用 BaCl2和考马斯亮蓝 G-250 试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收集液合并于离心管中，标记“脱盐”备用。4酶活力测定粗酶液 0.05ml 加蒸馏水 稀释至 25ml，摇匀待用盐析液 0.05ml 加蒸馏水 稀释至 25ml，摇匀待用脱盐液 0.
5、2ml 加蒸馏水 稀释至 10ml，摇匀待用空白 标准葡萄糖浓度梯度 粗酶液 盐析液 脱盐液0 1 2 3 4 5 A0 A1 B0 B1 C0 C1葡糖糖液(ml) 0.0 0.22 0.4 0.6 0.8 0.9 淀粉酶液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1H2O(ml) 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.3 pH6.8 缓冲液 1 1 1 1 1 1NaOH 溶液(ml) 1 1 1预热 摇匀，37水浴，5min预热的淀粉酶 各 1ml 迅速摇匀酶促反应 37水浴，5minNaOH 溶液(ml) 1 1 1DNS 试剂 各 2ml 迅速摇匀显色反应 沸水浴
6、5min，冷却定容至 25ml，摇匀比色 以 0 号管为空白参比，测定 =540nm 处的吸光度记录吸光度 0.000 0.025 0.098 0.191 0.276 0.28 0.172 0.295 0.145 0.493 0.216 0.396还原糖（mg） 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 0.900 0.5092 0.9633 0.7408标 准 曲 线 y = 0.4363x - 0.0728R2 = 0.999400.050.10.150.20.250.30 0.2 0.4 0.6 0.8 1浓 度吸光值 系 列 1线 性 (系 列 1)5蛋白质含量测定粗
7、酶液 0.5ml 加蒸馏水 稀释到 10ml，摇匀；盐析液 1.0ml 加蒸馏水 稀释到 10ml，摇匀；脱盐液直接取用；样品处理：取样 2g 豆芽 研磨 水 100ml 定容，摇匀 浸提 10min 过滤取 14 支试管按下表操作并记录实验数据。空白 标准蛋白质浓度梯度 样品 1 粗酶液 盐析液 脱盐液0 1 2 3 4 5 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 BSA 标准液(ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9样品待测液(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0Folin-酚试剂甲(ml)各 5ml反
8、应 各管混匀，室温下放置 10minFolin-酚试剂乙(ml)各 0.5ml反应 及时混匀，室温下放置 30min比色 以 0 号管为空白参比，测定 =500nm 处的吸光度记录吸光度(A 500) 0.000 0.048 0.096 0.119 0.157 0.204 0.125 0.117 0.179 0.195 0.194 0.204 0.166 0.157平均值(A500) 0.121 0.187 0.199 0.162六、数据处理1 各样液浓度粗酶液浓度 0.3115./2mgAll盐析液浓度 ./62/44VllBmgll脱盐液浓度 0.60.62/.098/(21)(.1)ml
9、lglC ll2 各酶的活力计算粗酶液：A=A 1-A0=0.337-0.177=0.160代入 y=0.5064x-0.0774 中得m 粗 =0.469mg粗酶液样品量 3.51./0.26.102mlglml gl 粗酶液淀粉酶活力 30.4695.9/inU样品总活力=15.129U/mg310mg=4688.99U盐析液B=B 1-B0=0.410-0.313=0.097代入 y=0.5064x-0.0774 中得m 盐 =0.344mg盐析液样品量0.562/0.15.86mlgl mgl盐析液淀粉酶活力.343.9/5in086Ug样品总活力=3.699U/mg310mg=114
10、6.69U脱盐液 C=C 1-C0=0.445-0.207=0.238代入 y=0.5064x-0.0774 中得m 脱 =0.623mg脱盐液样品量.26.098/0.15.01831mlglmlgl脱盐液淀粉酶活力.36.89/5in08Ug样品总活力=6.809U/mg310mg=2110.79U3 纯化回收率 盐析后回收率 盐 析 液 的 酶 活 力 146.9U0%10%24.5粗 酶 液 的 活 力 8脱盐后回收率 脱 盐 液 的 活 力 2.71.粗 酶 液 的 活 力 4694 蛋白质的含量测定样品 1样品 1 的 =0.121A代入 y = 0.0008x - 0.0011
11、得 样 =152.625ug=0.153mgm即得 1ml 样品 1 液的蛋白质含量=0.153mg样品 1 的蛋白质总含量 0.153mg 蛋白/ml 样液100ml=15.3mg豆芽中蛋白质含量0.5310%.7652g粗酶液粗酶液的 =0.187B代入 y = 0.0008x - 0.0011 得 粗 =235.125ug=0.235mgm1mg 粗酶液中蛋白质的含量 0.1530.1530.197蛋 白 /mg样 品Ag/mll .llgl l称样总蛋白的含量=0.197mg 蛋白/mg 样品310mg=61.07mg盐析液盐析液的 =0.199C代入 y = 0.0008x - 0.
12、0011 得 盐 =250.125ug=0.250mgm1mg 盐析液中蛋白质的含量 0.250.250.43蛋 白 /mg样 品B6g/l1ml1.l1lgl ml称样总蛋白的含量=0.0403mg 蛋白/mg 样品310mg=12.493mg脱盐液脱盐液的 =0.162D代入 y = 0.0008x - 0.0011 得 脱 =203.875ug=0.204mgm1mg 脱盐液中的蛋白质的含量 0.240.240.35蛋 白 /mg样 品16.98/1.gColll 称样总蛋白的含量=0.0335mg 蛋白/mg 样品310mg=10.385mg5 比活力计算粗酶液比活力468.9U76.
13、81/mg10g盐析液比活力/2493脱盐液比活力210.79U23.54/mg385g6 纯化倍数盐析液纯化倍数盐 析 液 比 活 力 91.78/1.95粗 酶 液 比 活 力 6Ug脱盐液纯化倍数脱 盐 液 比 活 力 203.54/2.647粗 酶 液 比 活 力 m讨论1、蛋白质的测定方法考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝法对玻璃吸附较大，每次用完比色皿都需要酒精清洗，而且对于操作要求较高，每加一种试剂都要迅速摇匀，因为考马斯亮蓝试剂是用浓磷酸和乙醇配置的，如不摇匀，会导致蛋白质变性。适用于测定可溶性蛋白。紫外吸收法：此法简单易行，直接将蛋白质溶液置于 280nm 下进行吸收测定即可。要求使用
14、石英比色皿，而且如用分光光度计测定，待测样品必须很纯，否则有杂质的话会造成影响。适用于可溶性蛋白。双缩脲法：双缩脲试剂即为碱性铜离子溶液，可与蛋白质生成紫色络合物，在 500nm波长处测其吸光度即可。但其灵敏度比较低，且只适用于可溶性蛋白质的测定。凯氏定氮法：此法是将蛋白质当中的蛋白 N 全部转化为氨态 N，再将其蒸发出，用硼酸吸收后再用盐酸滴定。通过滴定所用掉的盐酸的量计算出 N 的含量，对照经验系数，即可大致得出蛋白质的含量。适用于全部蛋白质。Folin-酚比色法：用于测定可溶性蛋白质，灵敏度高，测定范围为 25-250ug，操作简便，是实验室最常用的方法之一。但要注意试剂甲中的 OH含量
15、不能过高，否则Cu2+会沉淀。2、酶活力也称为酶活性，用来衡量酶的多少，是指酶催化一定化学反应的能力。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反应的速率来衡量没活力的大小。酶催化的反应速率越大，酶的活力越高，反之，酶活力越低。酶活力表示方法：国际单位（IU）：在 25，其他条件均为酶的最适条件下，每 min 转换 1umol 底物需酶量为一个活度单位，IU。（1） 终点法：测定完成一个反应所需要的时间自定义单位 （2）动力学法：测定酶催化反应的初速度 3、比活力：国际酶学委员会规定酶的比活力为每毫克蛋白质所含有的酶活力单位数，以酶的活力单位/mg 蛋白质表示。酶的比活力用来衡量酶的纯度，对于同一种酶
16、来说，比活力越大，酶的纯度越高。比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。4、纯化回收率：用来衡量酶的纯化的好与差，纯化回收率值越高，则纯化方法越好。纯化回收率一定小于 1，因为每纯化一步，都会有部分蛋白损失，回收率就下降点。 每 次 总 活 力纯 化 回 收 率 0%第 一 次 总 活 力盐析后回收率不是很高，推测原因可能是部分酶在实验过程中损失或者部分酶失活。脱盐后的回收率按理说应小于盐析后的回收率，而实验测得相反，可能是盐析后的淀粉酶液中存在(NH) 2SO4，对淀粉酶的活性起了抑制作用。5、纯化倍数：表示纯化效果，纯化倍数越高，纯化效果
17、越好。 每 次 比 活 力纯 化 倍 数 10%第 一 次 比 活 力6、纯化回收率和纯化倍数是用来评价一个纯化方法好与差的指标。纯化回收率越高则纯化过程中酶的损失越少，体现了纯化方法的效果；纯化倍数反映的则是酶纯化效果的好于差，一般大于 1，纯化后比活力提高越多，即纯化倍数越高，总活力损失越少，即回收率越高，纯化效果越好。7、蛋白质的纯化方法等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
