1、流式细胞术的特点及其在CD4细胞检测中的应用,BDB HIV 陈放 2014,学习目标,流式细胞仪原理（掌握） CD4细胞相关免疫知识（掌握） 检测结果存储，解读（掌握） 手动圈门（了解）,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,认识流式细胞仪BD公司,BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S.
2、Dickinson 于1897年在纽约创立的,位居财富周刊500强 1973年BD推出世界第一台流式细胞仪 FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） 市场占有率：全球75%，中国70%, 中国CDC95以上,认识流式细胞仪BD公司,BD公司流式细胞仪分为二大类： 一类为临床型（Clinic），其特点为仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。BD公司的临床型FCM FACSCan也是最早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。 另一类为科研型（Research）,其特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分
3、选到特定的培养孔或板上，并且可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛的科学研究应用。,认识流式细胞仪BD公司,CD4检测领域-完善强大的产品线,To be Launched,CD4检测-设立全球范围的检测标准,CD4检测BD在中国,BDCD4检测的黄金标准！,15,61,8600,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,人体免疫,人体的两道防线 固有性免疫（非特异性免疫） 皮肤，粘膜，巨噬细胞，NK细胞 获得性免疫（特异性免疫） T细胞，B细胞,人体免疫,获得性免疫 细胞免疫
4、T淋巴细胞 辅助性T细胞，杀伤性T细胞 体液免疫 B淋巴细胞,Lymphocytes,Granulocytes,Monocytes,(Macrophages),Erythrocytes,T Helper,T Cytotoxic,Eosinophils,Neutrophils,血细胞分化及生长,CD分子-白细胞分化抗原,白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原,淋巴细胞的免疫表型,CD19,淋巴细胞的免疫分型,淋巴细胞为CD45强阳性、颗粒度较低的一群细胞 淋巴
5、细胞 T淋巴细胞：CD3+，反映细胞免疫功能 T辅助细胞：CD3+CD4+ T抑制/细胞毒：CD3+CD8+； B淋巴细胞，CD19+，与体液免疫功能有关； NK细胞： CD16+56+/CD3- ，执行免疫监视功能,CD4细胞检测原理,CD4细胞是HIV病毒的主要攻击对象,CD4细胞检测原理,CD4细胞数量与病程紧密相关,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,认识流式细胞仪,定义：在流动的状态中检测单个细胞的多项理化及功能性指标的一种细胞分析技术 特点：特异、灵敏、多元化、高
6、速、客观、省时,什么是流式细胞术？,流式细胞仪就是测量染色细胞标记物荧光强度的分析仪,流式细胞术提供的信息：- 相对细胞大小- 相对细胞颗粒密度和内部复杂度- 染色细胞的相对荧光强度,认识流式细胞仪,认识流式细胞仪FACSCount,FACSCount是专门用于测试艾滋病人CD4细胞相关信息的台式仪器,认识流式细胞仪FACSCalibur,经典的流式细胞仪双激光(488nm,635nm) 六参数 自动进样装机（可选）,BD FACSCalibur的组成,液流系统引导和聚焦细胞以供检测 光学系统发射和收集光信号 电子系统将光信号转化为电子信号，数字化，传到计算机,认识流式细胞仪,液流系统,鞘液
7、样本流 压力系统 流动室,液流系统：鞘液桶和上样针,光学系统,激发系统包括: 激光器 一系列用以聚焦引导光路的棱镜光学收集系统包括: 一系列的光收集镜用以收集光信号 一系列的反射镜和透镜用以将一定范围波长的光信号引导到相应的收集系统,光学系统,两种信号，6个参数,FL1 FL2 FL3 FL4,FSC SSC,散射光信号,荧光信号,光学系统,FSC（前向角散射光） 代表细胞大小 SSC（侧向角散射光） 代表细胞粒度,SSC,FSC,Incident Light Source,人外周全血经过红细胞裂解后,光学系统,携带有不同荧光染料的细胞通过激光激发，产生不同的荧光信号,什么是荧光素,荧光素吸收
8、激光器发出光的能量 荧光素放出吸收的能量： 振动能和热能. 释放出更长波长的光,细胞检测原理荧光素,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,发射光强度与抗原表达之间的关系,FITC,Fluorescent Intensity,Number of Events,荧光素,CD3,CD19双荧光染色,CD19单阳性细胞,CD3单阳性细胞,将光学信号转换成电子信号,Parameter SSC FL1 FL2 FL3,Voltage In,PMT Power Supply,Levels 150999 Volts,Photon In,Signal Out,
9、LOG,Time,FL3,Time,FL2,Time,FL1,Time,SSC,Voltage Pulses,LIN,LOG,电子系统,认识流式细胞仪总结,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,淋巴细胞的免疫表型,CD19,T淋巴细胞的免疫表型,T淋巴细胞分类复杂，不同类型免疫表型的T淋巴细胞的功能不同 根据CD4、CD8的表达，T淋巴细胞可分为 T helper/T inducer（CD3+CD4+） T suppressor/ T cytotoxic（CD3+CD8+）,如
10、何用流式细胞仪检测相应的特定细胞？,第一步：确定待测细胞的特征,CD# 特异性 CD45 白细胞 CD3 T淋巴细胞 CD4 T辅助细胞 CD8 T抑制细胞 CD19 B细胞 CD16,56 NK细胞,检测平台BD FACSCount,FACSCount是专门用于测试艾滋病人CD4细胞相关信息的台式仪器单激光，双色,双色预配试剂CD4/CD3 CD8/CD3,检测试剂BD FACSCount,检测平台BD FACSCalibur,经典的流式细胞仪 双激光(488nm,635nm) 四色 六通道 自动进样装置机（可选）,检测平台BD FACSCalibur,单激光(488nm) 三色 五通道 机
11、（可选）,检测试剂BD FACSCalibur,试剂+绝对计数管,三色试剂 CD4/CD8/CD3 CD3/CD4/CD45四色试剂 CD3/CD8/CD45/CD4,细胞检测原理试剂的选择,特定抗原,第二步：确定钓鱼的鱼饵（抗体）,单克隆抗体,第三步：使得结合抗体的细胞得以检测 将荧光素标记在抗体上,T,T,T,C,H,CD3,CD3,CD3,CD8,CD4,标记上不同荧光单克隆抗体的T细胞亚群,双荧光染色散点图分析,CD8 PE,CD4 FITC,0,10,102,103,104,105,CD4细胞检测流式检测流程回顾,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4
12、检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,用FACSCalibur检测外周血中的CD4细胞,移液器的校准，正确的加样方法 试剂的选择：CD4/CD8/CD3，CD3/CD8/CD45/CD4 完成溶血后免洗的实验步骤 使用MultiSet自动化软件上机 绝对计数管的使用,加样注意事项,反向加样法 枪头不能接触到其他液体或微球 充分混匀,TruCOUNT管绝对计数原理,TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致 样本与beads充分混合，同时检测； 通过如下公式计算各细胞亚群绝对值：细胞获取数 Bead
13、s总量细胞/L= Beads获取数 样本量 使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本 操作简便，绝对计数结果的重复性好,TruCOUNT管绝对计数原理,举例：微球： 100个样本量： 50ul获取细胞: 200个获取微球： 50个每ul血液含有细胞数目 = ？,内容安排,BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A,用FACSCalibur检测外周血中的CD4细胞,上机三部曲： 使用绝对计数管制备样品 用MultiSet软件获取样品手动分析结果（可选） 读取分析结果,第一步：实验样本制备,64,两个
14、15分钟,65,调用BD FACSComp生成的Lyse/No-Wash实验条件Calib File.LNW,第二步：MultiSET 软件的使用,66,Place populations on scale in SSC (if needed). Adjust FL3 threshold to get rid of most of the debris. Save optimized settings.,Trucount beads,lymphocytes,67,Specify data collection information (file name, storage location,
15、panels, etc.). Click Acquire. Gate manually, if needed. Print or export results, if needed.,第三步：数据分析，读取结果,数据分析读图，手动设门,以CD3或者CD45所在的荧光通道设定阈值，去除血标本中碎片等干扰 由CD3或者CD45/SSC点图设定淋巴细胞门或者T淋巴细胞门 在相应的荧光点图上预设Attractor，由Attractor自动找到细胞亚群 由软件根据计数微球自动计算每一种细胞群体的数量，并给出结果,何时需要进行手动设门？,当细胞群体的位置出现变动时，软件无法正确圈定细胞，出现门的偏移或者错误时，我们需要人工调整门的位置,Thanks!,谢谢观看,希望提出指导与建议,
