1、实验 0Y 果蝇遗传标记分析-PAPD,一、实验目的：1. 掌握RAPD分析基本方法技术;2. 了解分子标记的重要应用价值 .,二、主要内容：基因DNA提取 PCR反应 电泳 电泳图谱的观察、分析,助教： 王家文,（1）D.Virilis -10只 （2）黑腹果蝇P、F1、F2 （3）其他材料 - 0.2g,1份（3种果蝇样品+2种其他）/小组,果蝇用自己存的材料。,材料：,1. 提取粗DNA液,现在先做（合理分工、协调时间）：,每份材料（普通果蝇20只、大果蝇10只、或其他材料0.2g）,+50L匀浆缓冲液匀浆,液体倒入1.5ml离心管,+等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀30s,12000r
2、pm， 5分钟。,助教把握时间！,+ 50 L 10%SDS颠倒混匀20s，65度水浴30min,加入200L的匀浆液,10000rpm，3min，转移上清。,移上清于另一离心管，+等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀，13000rpm， 5分钟。,12000rpm，10min,移上清于另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，静置10min。,弃上清，70%乙醇洗涤沉淀， 10000rpm，3min,弃上清，超净台吹干沉淀。加入20ul的无菌水，溶解沉淀，备用。,注意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的移动，不要带入其它杂质。,（1） 组织匀浆液（已经准备好
3、） ： LiCl 0.40 molL-1 TrisHCl 0.20 molL-1（pH9.0） EDTA 2.5 mmolL-1RNaseA 100 gL-1,（2）SDS 10% （已经准备好）,相关试剂,(3) 25 x TAE(在15离心时配制) 500ml 用于后边的电泳 Tris 12.1 g 冰醋酸 2.86 mL Na2EDTA2H2O 1.86 g ddH2O 定容到100 mL (一人配置，全班公用，用时稀释),三、实验原理 :,RAPD:建立在PCR基础上的一种分子标记。模板高温变性足够低的温度下（通常为36）与随机引物（一般10个bp）退火 PCR 电泳如果两个退火位点足
4、够近（200-2000bp左右）、分别位于互补的DNA链上，可以通过PCR扩增出DNA片段。,引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。,若位点2处碱基发生改变，则,3. RAPD反应,1在0.2ml PCR管中配制20l反应体系,随机引物 1L ddH2O 6L,每组领取5份样品所需量,各组等分5份,分别加5种样品的模板DNA 各 3L,包括 dNTP Mixture, Taq酶, 10PCR buffer,PCR mixture 10 L,2在PCR热循环仪中进行如下反应：
5、94 200s 94 60s36 60s72 120s 40个循环72 (300s-600s),4电泳（后继课中*） 1.5%琼脂糖凝胶（用20mL的1TAE溶解琼脂糖配制）电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。,*第12周“非中断杂交实验”的“扩菌、倒所有的平板”步骤后（可以由一个同学提前一会儿进行）,操作分工技术问题注意事项,实验课老师助教指导：,注意听,实验报告（为果蝇系列实验的最后部分）： 1. 简单体现RAPD的实验原理、解决的问题； 2. 实验结果（照片）显示出来（信号弱的可用画模式图辅助体现），标出样品名称、差异条带等，进行分析。,补充知识（课后阅读）
6、：,RAPDRFLPAFLPSTRSNP,利用10个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增DNA片段，一般一个引物可扩增6-12条DNA片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。RAPD是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。,RAPD,是英文Restriction Fregrmeat Length Po1ymor Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探
7、针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。,RFLP,RFLP,RFLP,AFLP:,Amplified Fragment Length Polymorphism. AFLP technology combines the power of Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) with the flexibility and power
8、of PCR.,“AFLP”续：,由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另一品系的DNA片段复制（扩增）。电泳分离：同一引物扩增,品系1,品系2,引物如：EcoRI和MseI相关引物,荧光标记全自动AFLP原理与方法,短串联重复序列STRs (short tendem repeats, mini-satellites ),STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个，主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)
9、n ， (GT)n 为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。,可变数目串联重复序列VNTRs (variable number tandem repeats),每个 VNTR 都含有10-15 bp核心序列，VNTR与STR比较类似，但是重复顺序更长；多态性及分布方面不如STR，因而VNTR作为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，但是，VNTR曾经对STR的基因定位运用起到推动作用。,定义：不同个体间，基因组DNA某部位的 单核苷酸的变异。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（single nucleotid polym
10、orphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。可通过杂交、序列分析、电泳等检测。,单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）,1，The most abundant DNA marker present in the human genome， about 90% of sequences variants in human are SNP. There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to th
11、ree million SNPs. 2，A few hundred thousand are currently identified, but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3, SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs, about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.,Frequency of SNP in Human Genome,1, Neutral alteration: a b
12、ase substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2, Conservative change: a base substitution that results in an altered amino acid, but has minimal effect on protein structure or function.3, Non-conservative alteration: leading to a change in the encoded amino acid residue that has
13、dramatic effects on protein structure or function.,The Functional Effects of cSNPs,Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it. These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput(高通亮) assays for screening therapeutic compounds.,
