1、Teixobactin - 30年来首个新抗生素,报告人：唐汉卿,2016.4,读书报告,前言,1,报告框架,1. Teixobactin的发现与效果2. 活性测试3. 合成,1. Teixobactin的发现,Kim Lewis, Source: Northeastern Universiry, Boston, USA,“I thought: Aw, damn it,” says Lewis. “We discovered a detergent.” 粗译：啊，我勒个去，我们发现了一种新型清洁剂。,3,iChip,支撑板,中心板-中间有琼脂,1. Teixobactin的发现,4,1%50%
2、,1. Teixobactin的发现,从10,000种多种化合物中筛选具有抗S. aureus活性的化合物，发现了来自于Eleftheria terrae菌（G-）的一种活性非常高的化合物，命名为Teixobactin(TEIX),非核糖多肽体合成酶（NRPS）基因,5, 1,242Da 11个AA 4个D型 1个结构复杂氨基酸,报告框架,1. Teixobactin的发现与效果2. 活性测试3. 合成,2.活性测试,MIC(最小抑菌浓度)-Broth Microdilution(微量肉汤稀释法),0.002% 吐温805105 cells per mlBiological Replicate
3、s（生物学可重复性）CLSI 指导,6,2. 活性测试,Minimum bactericidal concentration (MBC)-最小杀菌浓度 S. aureus NCTC8325-4,20h，37,离心,MHA,24h，37,MBC定义为：杀死99.9%供试菌所需的最低药物浓度。 论文中，TEIX的MBC一般为2MIC。,7,重悬，涂布,2. 活性测试,Time-dependent kill-时间相关的杀菌,过夜培养，S. aureus HG003,MHB 1:10,000稀释,37，225rpm,2h-early exponential,5h-late exponential,10
4、MIC药物处理,37，225rpm,间隔取样，100 l；离心，PBS重悬，10倍连续稀释,MHA 计数,OD600=1.0，37孵育24h,8,2. 活性测试,Resistance studies-耐药性研究 S. aureus NCTC8325-4 at 1010 c.f.u.，在含有2，4，10 TEIX的MHA平板上37孵育48h，没有耐药菌出现，推断出现耐药突变的概率10-10； M. tuberculosis（结核分枝杆菌） 109 cells per ml，7H9培养基孵育3周后，依然没有菌落。, S. aureus ATCC 29213加入到含有teixobactin和oflo
5、xacin（氧氟沙星）的MHB培养基（OD600=0.01）中，连续传代培养，每隔24 h取样进行MIC检测。,This usually points to a non-specific mode of action, with accompanying toxicity 这种现象一般认为是非特异性作用形式，通常伴有毒性（DNA毒性、蛋白毒性、RNA毒性等）。,9,2. 活性测试,作用机制的探索 放射性标记，检测S. aureus的生物合成途径。 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(DNA), 3H-尿嘧啶核苷酸(RNA), 3H-亮氨酸 (protein), 和 3H-葡萄糖胺(peptidoglyc
6、an),TEIX的抑菌机制可能与万古霉素类似、与肽聚糖有关，是一个新的抑制肽聚糖合成的抗生素。,10,2. 活性测试,作用机制的探索 进一步验证。,UDP-MurNAc-pentapeptide（UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽）是细胞壁的前体物质。,11,2. 活性测试,作用机制的探索,后指数期的中等抗万古霉素金黄色葡萄球菌（ S. aureus （VISA）,抗万古霉素的lipid II变体,12,2. 活性测试,杀菌机制,13,2. 活性测试,其他实验总结,next,14,2. 活性测试,血浆蛋白结合实验方法,用LC/MS/MS分析的处理方法： buffer管和血浆管各取25 L至离心管；
7、离心管中分别加入等量血浆或buffer； 加入300 L含内标物的沉淀buffer（含有0.1%甲酸的冰 90/10 乙腈/水溶液），用来沉淀蛋白、释放药物。冰浴中漩涡振荡30 min，离心。 计算：游离%=（buffer管浓度/血浆管浓度）*100%,15,报告框架,1. Teixobactin的发现与效果2. 活性测试3. 合成途径,生物合成,化学合成,3.合成途径,GO,硫酯化酶,16,3.合成途径,化学合成 固相合成Teixobactin类似物,Yahya E. Jad,et al. Org. Lett. 2015, 17, 61826185,文章观点 空间位阻与外消旋作用； -胍基不
8、能在C-末端，已形成内酰胺； HATU是效率最高，反应最快的偶联试剂； 酯化步骤非常困难；HOAT可以提高酯化反应效率； PyAOP可以避免胍基侧链反应； 无L-allo-enduracididine 氨基酸。,17,3.合成途径,固相合成Teixobactin类似物,18,3.合成途径,另一种固相合成Teixobactin类似物的方法,文章观点() 先合成直链肽会导致无法酯化,因此起始序列是关键； 22%的收率； Phe, Gln 和Ile改为L型，MIC损失64倍； 无L-allo-enduracididine 氨基酸； AllocHN-D-Thr-OH基团的合成；,Anish Parmar ，et al. Chem Comm. 2016，view article online,a.20% PIP/DMF b.4 eq. allyl chloroformate(烯丙基甲酸酯)/8 eq. DIPEA in DCM, 1 h. c. 1: 5:96 TFA: TIS: DCM. 3 15 min.,d. 10 eq. Trt-Cl(三苯甲基氯), 15% Et3N in DCM, 1 h.,e. TFA : TIS :DCM = 2 : 5 : 93, 2 h.,19,20,3.合成途径,Lallo-Enduracididine的合成,21,THANK YOU！,
