1、1TCID50 测定方案20121123391 简介TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称 50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。将不同稀释度的病毒接种到 96 孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照 Reed-Muench 公式计算 TCID50值。2 试剂试剂 来源 保存条件DMEM-basic 培养基 Gibco，上海 4保存胰蛋白酶 Gibco， -20冻存胎牛血清 Fetal bo
2、vine serum Hyclone， -20冻存PBS Hyclone， -20冻存3 仪器与耗材仪器 规格 耗材 规格CO2 培养箱 细胞培养瓶 25cm2生物安全柜 无菌离心管 15mL，50mL倒置显微镜 一次性移液管 1mL，2mL，5mL，10mL显微照相系统 细胞培养板 96 孔高速冷冻离心机电子天平移液器液氮罐电冰箱4 细胞及培养基DF-1 细胞株细胞生长液（500mL）：20%FBS （胎牛血清）+1%双抗（青链霉素） +剩余用 DMEM 100mL 5mL 395mL细胞维持液（50mL）： 1%双抗（青链霉素）+ DMEM（无血清）+1%FBS 0.5mL 49mL 0.
3、5mL细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic + 20%FBS + 10%DMSO35mL 10mL 5mL4保存备用5 病毒株及培养方法禽流感病毒（Avian influenza virus ，AIV ） ，H5N1 株；禽白血病病毒 （Avian leukosis virus ，ALV ） ，HPRS-103 株；禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus ，IBV） ，H52株；2禽传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus ，IBDV ） ，B87 株。病毒培养方法：DF-1 细胞培养和鸡胚培养。6
4、操作步骤6.1 DF-1 细胞的传代1. 吸弃细胞培养瓶中旧的培养液；2. 加入灭菌 PBS 5mL 清洗细胞，重复两次；3. 加入 1ml 0.25%的胰蛋白酶消化；4. 约 40s 左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大） ，站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液 10mL，反复吹打瓶壁细胞( 吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散，之后取两只新的细胞培养瓶，开盖待用；5. 向原细胞瓶中再加入细胞生长液 10mL，并吹吸混匀，然后吸取约 7ml 细胞悬液加入到2 个新的培养瓶中；6. 37 5%CO2 中培养 3 天，期间观察细胞生长情况，细胞长至占瓶壁 70%-80%时可接
5、种病毒，长满可传代。6.2 DF-1 细胞的冻存1. 取生长 48-72h 的 DF-1 细胞，吸弃旧的培养液；2 .吸取无菌 PBS 5mL 清洗细胞，重复两次；3. 加入 1mL 0.25% 胰蛋白酶消化；4. 约 40s 左右后，加入 3mL DF-1 细胞生长液终止消化，并吹打细胞瓶壁，使细胞悬浮于生长液中；5. 吹吸细胞，使混匀，之后将细胞悬液转移至 50mL 无菌离心管中；6. 1000rpm，室温离心 10min；7. 弃上清，加入细胞冻存液，置-20、-80梯度冻存，最后保存于液氮中。6.3 TCID50 的测定6.3.1 96 孔板培养细胞1. 取 1 瓶长满的细胞，吸弃培养
6、瓶中旧的培养液；2. 吸取无菌 PBS 5mL 清洗细胞，重复两次；3. 向瓶内加入 1ml 胰蛋白酶消化；4. 约 40s 左右后（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大） ，站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液 10mL，反复吹打瓶壁细胞( 吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散； 5. 吸取一滴细胞悬液置于细胞计数板上，对细胞进行计数；6. 加入细胞生长液稀释细胞悬液至含细胞 22.2 万个/mL（约 4 万个/ 孔） ；7. 取一块 96 孔板，每孔加 100l 的细胞悬液（枪头紧贴孔的一侧壁且不接触孔底，缓缓将细胞打下去，每加 8 孔，将未加的细胞悬液均匀混合） ，铺好后静
7、置 5min 观察细胞，再放入 37培养箱中培养至细胞长到 70%-80%。6.3.2 96 孔板接种病毒1. 将病毒室温解冻。吸取细胞维持液 9mL，再吸取 1ml 病毒液，用 0.22m 微孔滤膜过滤至 15ml 无菌离心管中，记为 1 号管；2. 另取 10 只 1.5ml 无菌离心管，编号 2-11，将 1 中病毒悬液用细胞维持液 10 倍递次稀释3成 10-2 至 10-11 不同的稀释度；3. 弃去 96 孔板中的旧培养液（甩板法：紫外灭菌前将铺有纱布的托盘置于工作台灭菌） ，分别在每孔加入 100l 的无菌 PBS 洗涤，重复两次；4. 每孔接种 100l 上述梯度稀释的病毒液，
8、每个稀释度接种 8 孔。并设置 1 列正常细胞对照组，每孔加 100l 细胞维持液，37 CO2 培养箱中吸附 1h。 （图 1）图 1 96 孔板中病毒接种1：细胞对照组；2-12：为接种病毒组5. 1h 后每孔加入细胞维持液 100l，放入 37培养箱中继续培养。6. 每日在倒置显微镜下观察细胞病变（70%以上的细胞出现 CPE 判为感染） ，记录病变程度和孔数（并拍照） ，待细胞病变不再继续（约 72h 后）后判定并记录结果（表 1） 。表 1累 计病毒液稀释度 出现 CPE 孔数 无 CPE 孔数CPE 孔数 无 CPE 孔数出现 CPE孔所占的%10-110-210-310-410-
9、510-610-710-810-910-107 .按照 Reed-Muench 计算法计算（本实验用 100TCID50/0.1ml）：距离比例（高于 50%病变率的百分数 -50%）/ （高于 50%病变率的百分数-低于 50%病变率的百分数）X：lgTCID50=距离比例稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数TCID50=10-X/0.1ml 含义：将该病毒稀释 10X 接种 100l 可使 50%的细胞发生病变。示例：细胞对照组 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 4细胞病变情况统计及致病百分率计
10、算累 计病毒液稀释度出现 CPE孔数无 CPE孔数 无 CPE 孔数 CPE 孔数出现 CPE孔所占的%10-1 8 0 0 49 100%10-2 8 0 0 41 100%10-3 8 0 0 33 100%10-4 7 1 1 25 96.2%10-5 6 2 3 18 85.7%10-6 4 4 7 12 63.2%10-7 5 3 10 8 44.4%10-8 2 6 16 3 15.8%10-9 1 7 23 1 4.2%10-1010-11008831390000 按照 Reed-Muench 计算法计算 TCID50（本实验用 100TCID50/0.1mL）=0.7TCID50 数=0.71+6=6.7TCID50=10-6.7/0.1mL也既是说，此病毒之 10-6.7 接种 100L 可使一批细胞有 50%病变的可能性。
